Activación de nano

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 12748 (2022) Citar este artículo

1518 Accesos

18 altmétrica

Detalles de métricas

Si bien la radioembolización con microesferas de itrio-90 (Y-90) es un tratamiento prometedor para el carcinoma hepatocelular (CHC), las respuestas más bajas en tumores avanzados y de alto grado presentan una necesidad urgente de aumentar su eficacia tumoricida. El propósito de este estudio fue determinar si las microesferas de Y-90 utilizadas clínicamente activan nanofotosensibilizadores sensibles a la luz para mejorar el estrés oxidativo y la citotoxicidad de las células del carcinoma hepatocelular (CHC) en comparación con el Y-90 solo in vitro. La producción de oxígeno singlete y radicales hidroxilo mejoró cuando las microesferas Y-90 estaban en presencia de varios nanofotosensibilizadores en comparación con cualquiera de los dos solos en condiciones libres de células. Tanto las células HCC humanas SNU-387 como HepG2 demostraron una viabilidad significativamente menor cuando se trataron con microesferas Y-90 de baja actividad (0,1–0,2 MBq/0,2 ml) y un nanofotosensibilizador que consiste tanto en dióxido de titanio (TiO2) como en titanoceno (TC). marcadas con transferrina (TiO2-Tf-TC) en comparación con microesferas Y-90 solas o células no tratadas. El estrés oxidativo celular y la muerte celular demostraron una dependencia lineal del Y-90 en actividades más altas (hasta 0,75 MBq/0,2 ml), pero se acentuó significativamente en presencia de concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC en el SNU-387 pobremente diferenciado. Línea celular HCC (p <0,0001 yp = 0,0002 respectivamente) pero no la línea celular HepG2 bien diferenciada. La adición de TiO2-Tf-TC a las células THLE-2 de hepatocitos humanos normales no aumentó el estrés oxidativo celular ni la muerte celular en presencia de Y-90. La actividad tumoricida mejorada de los nanofotosensibilizadores con microesferas Y-90 es una estrategia de tratamiento complementario potencialmente prometedora para ciertos subconjuntos de pacientes. Se están realizando aplicaciones en modelos de CHC in vivo clínicamente relevantes.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es una neoplasia maligna hepática primaria que es la cuarta causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo y se espera que aumente aún más en las poblaciones occidentales con el aumento significativo de la enfermedad hepática crónica secundaria a la esteatohepatitis no alcohólica1,2,3. 4. A pesar de los avances recientes en agentes sistémicos como la inmunoterapia, persiste una cohorte sustancial de personas que no responden o responden mal a estos agentes, lo que requiere innovaciones terapéuticas5. La radioembolización con itrio-90 (Y-90) implica la administración mínimamente invasiva y guiada por imágenes de microesferas incrustadas con el radionúclido emisor beta puro de alta energía Y-90 a tumores hepáticos de una manera precisa y selectiva directamente a través de su suministro arterial, lo que da como resultado Radioterapia interna altamente concentrada6. Se logran respuestas objetivas efectivas y duraderas cuando se administran microesferas de Y-90 a tumores de CHC en altas dosis de radiación absorbida7,8,9. A pesar de esto, existen varias limitaciones para la radioembolización con Y-90, incluidas tasas de respuesta más bajas en pacientes con estadios avanzados de CHC, aquellos con tumores poco diferenciados y cuando no se puede lograr una dosis adecuada de radiación con Y-90 para el tumor debido a una mala vascularización. conductos o heterogeneidades de dosis significativas a nivel de microdosimetría10,11,12,13,14. Esto destaca la necesidad de innovar este paradigma de tratamiento para mejorar la eficacia citotóxica del Y-90 en dosis de radiación más bajas para extender sus beneficios de tratamiento a estos pacientes más vulnerables y de alto riesgo.

Los radionucleidos emisores beta emiten luz visible desde casi ultravioleta a azul, conocida como radiación Cerenkov (CR)15,16,17. Esta luz, junto con la energía directa de la partícula beta, puede activar fármacos sensibles a la luz conocidos como nanofotosensibilizadores para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) tumoricidas a través de un proceso de terapia fotodinámica (PDT) (Fig. 1A)17,18. In vivo, la TFD produce la muerte del tumor a través de procesos multidimensionales que involucran daño celular directo, cierre microvascular y activación de la respuesta inmune antitumoral a través de la muerte celular inmunogénica19. Trabajos anteriores han demostrado que los emisores de positrones como F-18, Zr-89 y Ga-68 pueden servir como fuentes eficaces de activación de nanofotosensibilizadores para producir esta PDT "independiente de la profundidad"18,20,21,22,23. Se ha demostrado que el Y-90 es uno de los emisores CR más brillantes y eficientes de todos los radionúclidos de uso médico, lo que, junto con su partícula beta de alta energía, lo coloca en una posición óptima para activar nanofotosensibilizadores para lograr una mayor eficacia tumoricida a través de una combinación de radioterapia y TFD24,25,26,27,28.

Y-90 emite una señal óptica varias veces mayor que otros radionucleidos emisores beta. (A) Los radionucleidos emisores de β, como el Y-90, emiten luz Cerenkov que alcanza su punto máximo en el espectro UV-azul cuando las partículas cargadas (es decir, β− o β+) exceden la velocidad de la luz en un medio particular. Esta luz, junto con el centelleo de la propia partícula cargada, puede estimular fármacos activables por luz (nanofotosensibilizadores) para producir especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de H2O y O2, introduciendo potencialmente mediadores terapéuticos adicionales para la muerte de las células cancerosas. (B) Salida óptica de amplio espectro de Y-90 (en forma Y-90Cl3) versus la de FDG y Zr-89 con actividades iguales (0,925 MBq) medida en un IVIS Illumina (exposición de 4 minutos, 4 agrupaciones, campo de 10 cm -de vista, f-stop 1, filtro abierto, excitación bloqueada). (C) Y-90 exhibió flujos de fotones cinco veces mayores que Zr-89 y más de 16 veces mayores que FDG. (D) Y-90 exhibió radiancias promedio seis veces mayores que Zr-89 y más de 17 veces mayores que FDG. Los valores representan la media ± desviación estándar de tres mediciones.

En este estudio, determinamos si el Y-90 en su forma de microesferas clínicamente utilizada podría activar nanofotosensibilizadores sensibles a los rayos UV para generar ROS tumoricidas e inducir la muerte de las células HCC in vitro en actividades que se aproximan a dosis de radiación absorbida inferiores a las típicamente requeridas para la respuesta del tumor HCC en la clínica según el modelo de Dosis de Radiación Interna Médica (MIRD) (< 180 Gy). Nuestros resultados mostraron que Y-90 tiene una salida de luminiscencia varias veces mayor que la de otros emisores beta utilizados clínicamente. El tratamiento de varios nanofotosensibilizadores con microesferas Y-90 generó oxígeno singlete tumoricida y radicales hidroxilo en medios libres de células. Utilizando un nanofotosensibilizador dual que consiste en dióxido de titanio (TiO2) y titanoceno (TC) marcado con transferrina (Tf) para facilitar la absorción de células tumorales (TiO2-Tf-TC), mostramos el tratamiento con microesferas Y-90 que activa el estrés oxidativo celular y mitocondrial. para mejorar la muerte celular en células SNU-387 HCC altamente malignas y poco diferenciadas29. Curiosamente, las células HepG2 HCC bien diferenciadas mostraron una mayor muerte celular con microesferas Y-90 solas en comparación con las células SNU-387, y esto no se mejoró con nanofotosensibilizadores. Es importante destacar que la adición de nanofotosensibilizadores no aumentó el estrés oxidativo ni la muerte celular por Y-90 en células hepáticas humanas normales. Estos resultados indican que Y-90, en su forma de microesfera utilizada clínicamente, puede activar nanofotosensibilizadores, lo que resulta en una mayor muerte celular de HCC con un impacto potencialmente mayor en ciertos subtipos histológicos. Estos resultados respaldan investigaciones adicionales sobre el uso de nanofotosensibilizadores como tratamiento complementario y las respuestas diferenciales del Y-90 solo entre varios subtipos de CHC.

Y-90Cl3 se obtuvo de Eckert y Ziegler Radiopharma (Berlín, Alemania). Tanto la fluorodesoxiglucosa (FDG) F-18 como el Zr-89 se obtuvieron y produjeron de conformidad con las buenas prácticas de fabricación (GMP) de un ciclotrón biomédico CS-15 en nuestra institución local. Se tomaron imágenes de fantasmas que contenían 0,925 MBq de cada radionúclido por triplicado en placas de 96 pocillos con fondo transparente y paredes negras, en un IVIS Illumina (PerkinElmer, Waltham, MA) con un filtro abierto, exposición de 4 minutos, 4 agrupaciones, campo de 10 cm. -vista, f-stop 1, bloque de excitación. La salida óptica de amplio espectro se midió mediante un análisis de región de interés utilizando Living Image Software versión 2.60.1 (PerkinElmer, Waltham, MA) para obtener valores de flujo de fotones (fotón/s) y radiancia (fotón/s/cm2/sr).

Para los ensayos de ROS sin células, se utilizaron como nanofotosensibilizadores hipericina (Millipore Sigma, Burlington, MA), nanopartículas de TiO2 anatasa 25 nM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y titanoceno (TC) formulados en albúmina sérica humana. Los nanofotosensibilizadores basados en TiO2 se sintetizaron de la manera descrita anteriormente18. Brevemente, se suspendieron nanopartículas de TiO2 anatasa de 25 nm de diámetro (Sigma Aldrich Co.) en agua desionizada para formar una solución madre de 10 mg/ml, que luego se mezcló vigorosamente con apotransferrina humana (Tf, Atenas Research and Technology, Atenas, GA). ), disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una proporción de masa de TiO2 a Tf de 1:3 y dispersado por sonicación a 3 W durante 60 s con un procesador ultrasónico Cole Parmer GE 130 PB (Cole Parmer, Vernon Hills, IL). La mezcla se filtró inmediatamente a través de un filtro de jeringa de polietersulfona (PES) de 0,22 µm (VWR Scientific, Batavia, IL) y se añadió 2 % en volumen de una solución de TC 12 mM (Alfa Aesar, Tewksbury, MA) en DMSO, produciendo TiO2. -Tf-TC. Las suspensiones se caracterizaron por tamaño con dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un sistema Malvern Zetasizer Nano ZS (Figura complementaria 1). Se utilizó un protocolo similar con un Tf etiquetado con Alexa680 de 12 µM (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) utilizando la relación de masa de TiO2 a Tf de 1:3 para producir TiO2-Alexa-Tf.

HSA-TC se sintetizó y caracterizó de la misma manera descrita anteriormente20. Brevemente, se tomaron 80 mg de TC en 16 ml de una solución acuosa de HSA al 0,5 % y la mezcla se agitó durante 6 h a 560 oscilaciones por minuto en un agitador de placa básico IKA KS 130 a temperatura ambiente. Luego, la mezcla se sometió inmediatamente a liofilización en un liofilizador con trampa de vapor refrigerada Thermo Fischer SAVANT RVT5105 para obtener la nanopartícula HSA-TC como un polvo seco de color rojo anaranjado. Los polvos secos se reconstituyeron en DPBS inmediatamente antes de su uso en los ensayos libres de células o en estudios celulares. Las distribuciones de tamaño y las concentraciones se confirmaron de la misma manera que se describió anteriormente20.

Las microesferas de resina Y-90 (SirSpheres, Sirtex, Woburn, MA) se obtuvieron como dosis de viales sobrantes no utilizadas después del uso clínico de rutina y se transfirieron a nuestro laboratorio bajo la aprobación y el protocolo institucional y de seguridad radiológica. Y-90 SirSpheres fue la única forma de microesfera utilizada en este estudio. Tanto los ensayos de oxígeno singlete como los de radicales hidroxilo libres de células se realizaron en placas de 96 pocillos, fondo transparente y paredes negras (Corning, Corning NY) con concentraciones apropiadas de nanofotosensibilizadores y actividades de microesferas Y-90 en un volumen total de 0,2 ml. en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Life Technologies, Carlsbad, CA). Para la medición de radicales de oxígeno singlete, se añadió reactivo verde del sensor de oxígeno singlete (SOSG) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para una concentración final de 5 μM en cada pocillo de condición experimental. La activación del reactivo SOSG por radical de oxígeno singlete se determinó midiendo la fluorescencia de excitación de 504 nm/emisión de 525 nm de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un lector de placas multimodo Synergy HT (BioTek Instruments Inc) inmediatamente antes y en varios momentos después de la adición de microesferas Y-90. hasta 48h. Las condiciones experimentales incluyeron PBS solo, nanofotosensibilizador solo (hipericina 500 nM, TC 1 μM o TiO2 50 μg/mL) y microesferas Y-90 solas (0,26 MBq/0,2 ml o 0,52 MBq/0,2 ml) como controles y nano -fotosensibilizador (hipericina 200 nM o 500 nM, TC 0,1 μM o 1 μM, o TiO2 10 μg/mL o 50 μg/mL) agregado a microesferas Y-90. Se eligieron las actividades de 0,26 MBq y 0,52 MBq ya que corresponden aproximadamente a 65 Gy y 130 Gy respectivamente, asumiendo el método de dosis de radiación interna médica (MIRD) en un volumen de espacio de 0,2 ml. La eliminación de radicales de oxígeno singlete se evaluó añadiendo azida de sodio (NaN3, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) a una concentración final de 5 μM a microesferas Y-90 más condiciones de nanofotosensibilizador. Cada condición experimental se repitió cinco veces.

Para la medición de radicales hidroxilo, se añadió reactivo de hidroxifenilfluoresceína (HPF) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a una concentración final de 5 μM a cada pocillo de condición experimental. La activación del reactivo HPF por el radical hidroxilo se determinó midiendo la fluorescencia de excitación de 490 nm/emisión de 515 nm de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el lector de placas anterior (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT) inmediatamente antes y en varios momentos después de la adición de Y-90. microesferas hasta 72 h. Las condiciones experimentales fueron idénticas a las del oxígeno singlete excepto por la ausencia de la condición experimental de azida sódica (NaN3). Cada condición experimental se repitió cinco veces.

Las células SNU-387 HCC fueron un generoso obsequio del Dr. Terence Gade (Departamento de Radiología, Universidad de Pensilvania). Las células HepG2 HCC se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). El perfil STR realizado en nuestra institución indicó que ambas líneas celulares coincidían con los estándares de referencia según las pautas de la ATCC. El estado de diferenciación de ambas líneas celulares se basó en las clasificaciones transcriptómicas de Caruso et al., con células HepG2 caracterizadas por estar bien diferenciadas, con características similares a hepatoblastos y SNU-387 como menos diferenciadas, invasivas, con características similares a mesenquimales29. Las células SNU-387 y HepG2 se mantuvieron en medios Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) y Eagle's Mínimo Esencial (EMEM) (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) respectivamente, ambos complementados con 10 % de feto. suero bovino (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 0,5%. La línea celular epitelial de hígado humano normal THLE-2 se obtuvo de ATCC (Manassas, VA) y se mantuvo en medio de crecimiento de células epiteliales bronquiales (Lonza, Basilea, Suiza) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 0,5 %. . Todas las líneas celulares se mantuvieron en una incubadora de CO2 (5%) humidificada con camisa a 37 ° C y se pasaron cuando confluyeron. Las pruebas centrales de nuestra institución para detectar contaminantes como micoplasma fueron negativas.

Después de crecer hasta la confluencia, las células SNU-387 se sembraron a una densidad de 8000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo transparente de paredes negras y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego, las células se trataron con nanofotosensibilizadores TiO2-Alexa-Tf. Tanto la microscopía confocal de campo claro como la de fluorescencia se realizaron a las 4, 24 y 72 h después del tratamiento utilizando un microscopio confocal Olympus FV1000 utilizando el canal de excitación/emisión AlexaFluor 633. La superposición de imágenes de fluorescencia y campo brillante con colores falsos se realizó utilizando el software Fluoview FV10-ASW de Olympus.

Después de crecer hasta la confluencia, todas las líneas celulares se sembraron a una densidad de 8000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo transparente con paredes negras (Corning, Corning NY) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego se añadió el nanofotosensibilizador dual TiO2-Tf-TC a una concentración final de 0 μg/ml (control), 10 μg/ml o 50 μg/ml y luego se incubó durante 2 h a 37 °C. Luego se agregaron microesferas Y-90 en actividades anticipadas bajas o altas. Dada la marcada heterogeneidad y sedimentación de las microesferas Y-90, la actividad exacta para cada pocillo experimental se obtuvo midiendo la luminiscencia del filtro abierto en un lector de placas multimodo Synergy HT (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT) inmediatamente después de agregar las microesferas Y-90. y normalizando a la obtenida a partir de curvas estándar generadas a partir de Y-90Cl3 con ganancias idénticas del lector de placas (Figura complementaria 2). Después de 72 h de incubación a 37 °C, se añadió HPF (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a cada pocillo para obtener una concentración final de 5 μM para evaluar el radical hidroxilo. Después de 30 minutos de incubación a 37 °C, se midió la fluorescencia usando excitación de 490 nm/emisión de 515 nm usando el lector de placas anterior. Se realizaron estos mismos pasos y condiciones experimentales para evaluar la producción de superóxido mitocondrial, excepto que después de las 72 h de incubación, se succionó el medio y se añadió reactivo MitoSOX Red (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a una concentración final de 5 μM según las instrucciones del fabricante. instrucciones. Después de 30 minutos de incubación a 37 °C, se midió la fluorescencia utilizando excitación de 510 nm/emisión de 580 nm. La muerte celular se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio (PI) (Millipore Sigma, Burlington, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando las mismas condiciones experimentales. Para cada concentración de nanofotosensibilizador, hubo al menos 5 experimentos sin Y-90 y 10 experimentos con diversas actividades de microesferas de Y-90.

Después de crecer hasta la confluencia, las dos líneas celulares HCC (SNU-387 y HepG2) se sembraron a una densidad de 8000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo transparente con paredes negras (Corning, Corning NY) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego se añadió el nanofotosensibilizador dual TiO2-Tf-TC a una concentración final de 0 μg/ml (control) o de 50 μg/ml y luego se incubó durante 2 h a 37 °C. Luego se agregaron microesferas Y-90 a actividades bajas (menos de 0,2 MBq/0,2 ml) y se incubaron durante 72 h. La actividad exacta de Y-90 se obtuvo mediante lecturas de luminiscencia en cada condición con referencia a estándares Y90-Cl3 como se describió anteriormente. La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo Cell Titre-Glo Luminiscencia (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia del Y-90 solo se tuvo en cuenta restando la luminiscencia de fondo obtenida justo antes de añadir el reactivo Cell-Titre-Glo. Cada condición experimental se realizó al menos por triplicado.

Después de crecer hasta la confluencia, las células SNU-387 se sembraron a una densidad de 10.000 células/pocillo en un portaobjetos con cámara de 8 pocillos (Corning, Corning NY) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego, las células se trataron con microesferas Y-90 (0,52 MBq/0,2 ml) solas, TiO2-Tf-TC (50 μg/ml) sola, microesferas Y-90 combinadas con TiO2-Tf-TC o sin tratar durante 72 h. Después de esto, se añadió a cada condición una tinción de células vivas/muertas que consistía en Cyto-dye para teñir células vivas y yoduro de propidio (PI) para teñir células muertas (Millipore Sigma, Burlington, MA) y se incubó a 37 °C durante 10 minutos. según las instrucciones del fabricante. El medio se succionó, se lavó con PBS y las células se fijaron con paraformaldehído (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Luego, las células se almacenaron a 4 °C hasta que el Y-90 se descompuso por completo (más de 10 vidas medias, aproximadamente 30 días). La microscopía confocal de fluorescencia de células vivas y muertas se realizó utilizando excitación de 488 nm/emisión de 518 nm y excitación de 488 nm/emisión de 632 nm, respectivamente, según las instrucciones del fabricante utilizando un microscopio confocal Olympus FV1000. La superposición de imágenes de fluorescencia y campo brillante con colores falsos se realizó utilizando el software Fluoview FV10-ASW de Olympus.

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.2 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Todos los datos sobre la producción óptica de radionúclidos, la producción de ROS sin células y la viabilidad celular se expresan como señal de ensayo en media ± desviación estándar. La significación estadística entre los grupos experimentales se evaluó mediante ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de HPF, MitoSox y PI basados en células se representaron versus la actividad de las microesferas Y-90 para cada concentración de nanofotosensibilizador. Se realizó una regresión lineal simple para cada concentración de nanofotosensibilizador y las diferencias en las pendientes se determinaron mediante ANOVA unidireccional. La significación estadística se estableció como alfa inferior a 0,05.

La luminiscencia de amplio espectro demostró que el Y-90 tenía una salida óptica brillante varias veces mayor que el F-18 o el Zr-89. Se tomaron imágenes de fantasmas que contenían actividades iguales (0,925 MBq) de fluorodesoxiglucosa (FDG) F-18, Zr-89 e Y-90 (en forma Y-90Cl3) en un IVIS Illumina (exposición de 4 minutos, 4 agrupaciones, campo de 10 cm). de visión, f-stop 1, filtro abierto, excitación bloqueada). Como se muestra en la Fig. 1, la luminiscencia óptica del Y-90 fue cinco veces mayor en comparación con el Zr-89 y más de 16 veces mayor en comparación con el F-18 (Fig. 1B), medida por el flujo de fotones (fotón/s) ( Fig. 1C) y radiancia (fotón/s/cm2/sr) (Fig. 1D), de acuerdo con cálculos y mediciones anteriores30.

La generación de radicales de oxígeno singlete, el mediador tumoricida primario de la terapia fotodinámica (PDT), se evaluó mediante el ensayo del sensor verde de oxígeno singlete (SOSG) con y sin diferentes actividades de microesferas Y-90 (0,26–0,52 MBq/0,2 ml, aproximadamente 65– 130 Gy suponiendo MIRD) y concentraciones de nanofotosensibilizador (Fig. 2). Se observó un aumento significativo en la producción de radicales de oxígeno singlete con concentraciones más altas de nanofotosensibilizador (más del triple con hipericina 500 nM Fig. 2A, más del doble con TC 1 μM, Fig. 2B; y hasta el doble con TiO2 50 μg/mL, Fig. 2C) cuando se combina con actividades bajas (0,26 MBq/0,2 ml) y superiores (0,52 MBq/0,2 ml) de microesferas Y-90 después de un tratamiento de 48 h (todos p < 0,0001). Este efecto fue abolido en presencia de azida sódica (NaN3), eliminador de radicales de oxígeno singlete, lo que indica que esta señal se debió de hecho a la producción de ROS31. La generación de radicales hidroxilo a lo largo del tiempo se evaluó mediante el ensayo de hidroxifenilfluoresceína (HPF) con y sin diversas actividades de microesferas Y-90 y concentraciones de nanofotosensibilizadores. Como se muestra en la Fig. 3, se observó un aumento de radicales hidroxilo con concentraciones más altas de cada actividad de nanofotosensibilizador y microesferas de Y-90 y aumentó con el tiempo hasta 72 h (poco más de una vida media de Y-90). De manera similar a la producción de oxígeno singlete, la producción de radicales hidroxilo a partir de hipericina o TC no pareció estar influenciada por actividades más altas de las microesferas Y-90 (Fig. 3A, B). Sin embargo, la generación de radical hidroxilo de TiO2 aumentó con actividades de microesferas Y-90 más altas (Fig. 3C). Ni el oxígeno singlete ni el radical hidroxilo fueron generados significativamente por las microesferas Y-90 o el nanofotosensibilizador solos en medios libres de células (Figs. 2 y 3), similar a otros resultados que utilizan radionucleidos emisores beta terapéuticos como el I-131 como plataforma. para PDT32. En general, estos datos demostraron que Y-90 exhibió una alta producción de luminiscencia y que la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mejoró notablemente con nanofotosensibilizadores y microesferas de Y-90 en condiciones libres de células.

La combinación de microesferas Y-90 con nanofotosensibilizadores da como resultado una producción mejorada de radicales de oxígeno singletes en medios libres de células. Se observó un marcado aumento en la producción radial de oxígeno singlete en presencia de nanofotosensibilizadores (A) hipericina 500 nM, (B) titanoceno unido a albúmina sérica humana (TC) 1 μM y (C) TiO2 50 μg/mL con ambos niveles bajos. y altas actividades de microesferas Y-90 en comparación con cualquiera de los dos solos. Este efecto disminuyó en presencia del eliminador de radicales de oxígeno singlete azida sódica (NaN3). Los valores representan la media ± desviación estándar de cinco mediciones. ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

La combinación de microesferas Y-90 con nanofotosensibilizadores da como resultado una mayor producción de radicales hidroxilo con el tiempo en medios libres de células. Se observó un marcado aumento en la producción de radicales hidroxilo en presencia de nanofotosensibilizadores (A) hipericina 500 nM, (B) titanoceno unido a albúmina sérica humana (TC) 1 μM y (C) TiO2 50 μg/mL con niveles bajos y bajos. Altas actividades de microesferas Y-90 en comparación con cualquiera de las dos por separado. Este efecto se hizo más pronunciado con el tiempo. Los valores representan la media ± desviación estándar de cinco mediciones. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Para experimentos con células HCC in vitro, utilizamos un nanofotosensibilizador dual marcado con transferrina (Tf) que consiste en TiO2 y TC (TiO2-Tf-TC), dado que trabajos previos demuestran una mayor eficacia tumoricida en comparación con nanofotosensibilizadores individuales con menor radiación. radionucleidos18. Además, se ha descubierto que el receptor de transferencia (TfR) está sobreexpresado en el CHC y trabajos previos con nanopartículas marcadas con Tf mostraron una alta acumulación dentro de los tumores de CHC en comparación con formulaciones no dirigidas in vivo33,34. Demostramos que esta construcción de nanofotosensibilizador marcada con AlexaFluor-680 se internaliza dentro de las células SNU-387 HCC (Figura complementaria 3). El estrés oxidativo celular evaluado mediante la producción de radicales hidroxilo y superóxido mitocondrial tanto en células SNU-387 poco diferenciadas como en células HepG2 HCC bien diferenciadas a las 72 h se probó utilizando los ensayos HPF y Mitosox respectivamente con varias actividades de microesferas Y-90 y concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC. Se eligió el análisis a las 72 h debido al aumento significativo en la generación de radicales hidroxilo en medios libres de células (Fig. 3) en este momento y fue un poco más de la vida media de Y-90. Como se muestra en la Fig. 4A, B, la generación de radicales hidroxilo aumentó en presencia de microesferas de Y-90 solas sin TiO2-Tf-TC y demostró una dependencia lineal de la actividad de Y-90 (Fig. 4A, aumento de 69,337 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 65 145–73 529, r2 = 0,99 para células SNU-387 y Fig. 4B, aumento de 4094 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 2932–5255, r2 = 0,92 para células HepG2). En células SNU-387 poco diferenciadas, las condiciones con concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC mostraron una generación de radicales hidroxilo significativamente mayor en presencia de microesferas de Y-90 en comparación con aquellas sin TiO2-Tf-TC, y se relacionó linealmente con Y-90. actividad (Fig. 4A, aumento de 88.426 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 %: 83.815–93.037 para TiO2-Tf-TC 10 μg/mL, y aumento de 111.557 HPF au por Y-90 MBq/0,2 mL, IC 95% 105,464–117,650 para TiO2-Tf-TC 50 μg/mL, ambos r2 = 0,99, p < 0,0001), lo que indica que TiO2-Tf-TC mejoró el estrés oxidativo en células HCC in vitro. Curiosamente, la adición de TiO2-Tf-TC a las células HepG2 bien diferenciadas no resultó en un aumento significativo en la generación de radicales hidroxilo (Fig. 4B, aumento de 5209 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 83 815 –93 037, r2 = 0,92 para TiO2-Tf-TC 10 μg/ml, y aumento de 5327 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 105 464–117 650, r2 = 0,91 para TiO2-Tf-TC 50 μg /ml, p = 0,1744).

El estrés oxidativo celular HCC de las microesferas Y-90 aumenta cuando se combina con nanofotosensibilizadores a las 72 h en SNU-387 pero no en células HepG2. (A) La producción de radical hidroxilo en la línea celular SNU-387 HCC depende linealmente de la actividad de las microesferas Y-90, pero es más pronunciada en presencia de concentraciones crecientes del nanofotosensibilizador de doble objetivo TiO2-Tf-TC (p < 0,0001). (B) Sin embargo, no se observaron diferencias en la producción de radicales hidroxilo en células HepG2 bien diferenciadas con la adición de TiO2-Tf-TC (p = 0,1744). (C) De manera similar, la producción de superóxido mitocondrial en células SNU-387 también depende linealmente de la actividad de las microesferas Y-90 y es más pronunciada en presencia de concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC (p = 0,0002). (D) Sin embargo, no se observaron diferencias en la producción de superóxido mitocondrial en las células HepG2 con la adición de TiO2-Tf-TC (p = 0,1087).

La producción de superóxido mitocondrial en células SNU-387 también aumentó en presencia de microesferas de Y-90 solas sin TiO2-Tf-TC en una relación lineal con la actividad de Y-90 (Fig. 4C, aumento de 44,941 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC 95% 37.002–52.880, r2 = 0,92). De manera similar a la observación con la generación de radicales hidroxilo, la generación de superóxido mitocondrial en células SNU-387 mejoró significativamente con concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC (Fig. 4C, aumento de 55.698 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % IC 48.665–62.732, r2 = 0,96 para TiO2-Tf-TC 10 μg/mL, y aumento de 68.740 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC 95% 60.940–76.540 r2 = 0,97 para TiO2-Tf-TC 50 μg/mL, p = 0,0002), lo que potencialmente indica estrés oxidativo mitocondrial, un subproducto terapéutico del Y-90 solo que se mejora aún más cuando se combina con nanofotosensibilizadores en esta línea celular35. Si bien la producción de superóxido mitocondrial también se relacionó linealmente con la actividad de Y-90 en las células HepG2, no mejoró significativamente al agregar nanofotosensibilizador (Fig. 4D, aumento de 10,690 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 8459 –12.922, r2 = 0,9288 para Y-90 sin TiO2-Tf-TC, aumento de 10.910 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC 95% 8319–13.501, r2 = 0,8752 para TiO2-Tf-TC 10 μg/ mL, y aumento de 14,452 MitoSox au por Y-90 MBq/0.2 mL, IC 95% 10,895–18,009, r2 = 0.8913 para TiO2-Tf-TC 50 μg/mL, p = 0.1087). En conjunto, estos datos mostraron que el estrés oxidativo celular de las microesferas Y-90 mejoró en presencia de nanofotosensibilizadores en SNU-387 pero no en células HepG2 HCC, lo que sugiere efectos diferenciales basados en subtipos histológicos.

Intentamos determinar si TiO2-Tf-TC induciría la muerte de las células HCC en combinación con actividades de microesferas Y-90 que de otro modo no serían tóxicas. Para probar esto, determinamos la viabilidad celular de las células SNU-387 y HepG2 mediante cuantificación de ATP tratadas con TiO2-Tf-TC con y sin bajas actividades de microesferas Y-90 (0,1–0,2 MBq/0,2 ml). Ambas líneas celulares demostraron una disminución significativa en la viabilidad celular con la combinación de microesferas Y-90 y TiO2-Tf-TC después de 72 h de tratamiento, pero no con ninguna de ellas sola, en comparación con las células no tratadas (Fig. 5A, p = 0,0002 para SNU-387). células, Fig. 5C, p = 0,0035 para células HepG2). Con actividades de Y-90 más altas (hasta 0,75 MBq/0,2 ml), determinamos la muerte celular utilizando tinción con yoduro de propidio (PI) dada la mayor interferencia de la emisión Cerenkov de Y-90 con ensayos de viabilidad celular basados en luminiscencia. Como se demuestra en la Fig. 5B, la muerte celular de SNU-387 dependía linealmente de la actividad de Y-90 (aumento de 60.793 PI au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 %: 44.126 a 77.459, r2 = 0,84), similar a la Hallazgos de radicales hidroxilo basados en células y superóxido mitocondrial. Sin embargo, las condiciones con concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC mostraron una muerte celular SNU-387 significativamente mayor en presencia de microesferas de Y-90 en comparación con aquellas sin TiO2-Tf-TC, y también se relacionó linealmente con la actividad de Y-90 (Fig. .5B, aumento de 81.450 PI au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 %: 71.662–91.238, r2 = 0,96 para TiO2-Tf-TC 10 μg/mL y aumento de 99.371 PI au por Y-90 MBq/0,2 mL, IC 95% 88.702–110.039, r2 = 0,97 para TiO2-Tf-TC 50 μg/mL, p = 0,0002). La microscopía confocal de tinción de células vivas/muertas de células SNU-387 no tratadas o aquellas tratadas con TiO2-Tf-TC solo (50 μg/mL) mostró principalmente células vivas (tinción Cyto-dye verde, figura complementaria 4). Por el contrario, las células tratadas con microesferas Y-90 solas mostraron un mínimo de células vivas restantes, mientras que las tratadas con microesferas Y-90 combinadas y TiO2-Tf-TC mostraron una ausencia total de células vivas, presencia de células necróticas (tinción PI roja) y una abundancia de desechos celulares (Figura complementaria 4). Las células HepG2 demostraron una tasa lineal y aumentada de muerte celular con actividad Y-90 sola en comparación con las células SNU-387 (Fig. 5D, aumento de 120.334 PI au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 %: 106.360–134.309, r2 = 0,9234 para HepG2 frente a un aumento de 60.793 PI au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 %: 44.126–77.459, r2 = 0,8404 para células SNU-387, p < 0,0001). De manera similar a lo observado con la producción de radicales hidroxilo y superóxido mitocondrial, la muerte celular no mejoró con la adición de nanofotosensibilizadores en las células HepG2 (Fig. 5D, aumento de 118.912 PI au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 %: 102.727 –135.097, r2 = 0,89 para TiO2-Tf-TC 10 μg/mL y aumento de 141.732 PI au por Y-90 MBq/0,2 mL, IC 95% 123.651–159.814, r2 = 0,9009 para TiO2-Tf-TC 50 μg/ ml, p = 0,0886). En general, demostramos que los nanofotosensibilizadores mejoraron significativamente la citotoxicidad del HCC mediada por microesferas Y-90.

La citotoxicidad de HCC de las microesferas de Y-90 aumenta cuando se combinan con nanofotosensibilizadores a las 72 h. (A) La viabilidad celular SNU-387, medida mediante cuantificación de ATP, disminuye con la combinación de microesferas de TiO2-Tf-TC y Y-90 en una actividad que no causa una disminución en la viabilidad celular con Y-90 solo (0,1–0,2 MBq/0,2 ml) (p = 0,0002). (B) La muerte celular SNU-387, medida por la absorción de yoduro de propidio, depende linealmente de la actividad de las microesferas Y-90, pero es más pronunciada en presencia de concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC (p = 0,0002). (C) Las células HepG2 también mostraron una viabilidad disminuida con la combinación de microesferas de TiO2-Tf-TC e Y-90 en actividades bajas (p = 0,0035). (D) Sin embargo, TiO2-Tf-TC no resultó en una mayor muerte celular en células HepG2 con actividades Y-90 más altas, según lo evaluado por la absorción de yoduro de propidio (p = 0,0886). Es de destacar que el grado de muerte celular por actividad Y-90 sola fue más significativo con las células HepG2 que con las células SNU-387 menos diferenciadas (p <0,0001). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para comparaciones múltiples ANOVA en (A) y (C).

Intentamos determinar si TiO2-Tf-TC aumentaba el estrés oxidativo y la muerte celular en células hepáticas humanas normales, lo que tendría implicaciones con toxicidades adicionales no deseadas de este tratamiento combinado. Como se muestra en la Fig. 6A, hubo una relación lineal con la actividad Y-90 y la generación de radicales hidroxilo en las células THLE-2, pero esto no aumentó cuando se cotrató con concentraciones aumentadas de TiO2-Tf-TC (aumento de 24,593 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 17 438–31 748, r2 = 0,81 para Y-90 sin TiO2-Tf-TC, aumento de 26 016 HPF au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 20 808– 31.224, r2 = 0,90 para TiO2-Tf-TC 10 μg/mL, y aumento de 24.593 HPF au por Y-90 MBq/0,2 mL, IC 95% 17.438–31.748, r2 = 0,81 para TiO2-Tf-TC 50 μg/mL ml, p = 0,387). Si bien hubo una tendencia hacia una mayor producción de superóxido mitocondrial en células THLE-2 con la adición de TiO2-Tf-TC, esto no fue estadísticamente significativo (Fig. 6B, aumento de 7590 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % IC 5640–9540, r2 = 0,84 para Y-90 sin TiO2-Tf-TC, aumento de 8935 MitoSox au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95 % 6240–11 630, r2 = 0,80 para TiO2-Tf-TC 10 μg/mL, y aumento de 10,175 MitoSox au por Y-90 MBq/0.2 mL, IC 95% 8606–11,743, r2 = 0.94 para TiO2-Tf-TC 50 μg/mL, p = 0.1923). Si bien también hubo una relación lineal esperada con la muerte celular THLE-2 y la actividad de Y-90, esta no aumentó al agregar TiO2-Tf-TC (Fig. 6C, aumento de 250,102 PI au por Y-90 MBq/0.2 mL, IC del 95% 233.598–266.606, r2 = 0,99 para Y-90 sin TiO2-Tf-TC, aumento de 239.867 PI au por Y-90 MBq/0,2 ml, IC del 95% 227.952–251.782, r2 = 0,99 para Y-90 con TiO2-Tf-TC 10 μg/mL, y aumento de 201.086 PI au por Y-90 MBq/0,2 mL, IC 95% 180.258–221.914, r2 = 0,97 para Y-90 con TiO2-Tf-TC 50 μg/mL) . Como se esperaba, los nanofotosensibilizadores no aumentaron el estrés oxidativo ni la muerte celular en las células epiteliales hepáticas normales.

Los nanofotosensibilizadores no aumentan el estrés oxidativo ni la muerte celular en los hepatocitos humanos normales. La producción de (A) radical hidroxilo, (B) superóxido mitocondrial y (C) muerte celular en células THLE-2 dependía linealmente de la actividad de Y-90, pero no aumentó en presencia de TiO2-Tf-TC.

Dado que Y-90 es uno de los emisores Cerenkov más brillantes y eficientes de radionucleidos emisores beta utilizados clínicamente, planteamos la hipótesis de que también sería un activador viable de nanofotosensibilizadores para mejorar la actividad tumoricida de HCC24. Aquí demostramos que Y-90, específicamente en su forma de microesferas clínicamente utilizada (SirSpheres), activa nanofotosensibilizadores sensibles a la luz para generar radicales de oxígeno singlete tumoricidas entre otras ROS en medios libres de células, que es un mediador clave de la TFD. Además, esto resultó en efectos diferenciales en líneas celulares de HCC in vitro, con una mayor producción de hidroxilo celular y superóxido mitocondrial junto con una mayor citotoxicidad en la línea celular de HCC SNU-387 poco diferenciada, pero no en la línea celular de HCC HepG2 bien diferenciada. Esto corrobora trabajos anteriores que demuestran que los emisores beta de baja radiación, como F-18, Zr-89 y Cu-64, pueden activar nanofotosensibilizadores para permitir la TFD independiente de la profundidad para tratar diversas neoplasias malignas18,20,21. Además, si bien algunos emisores beta como el Ga-68 demuestran una radiación Cerenkov comparable a la del Y-90, este último tiene la ventaja terapéutica de una vida media más larga (68 min frente a 64,1 h) y una emisión beta-menos de alta energía que permite la emisión concurrente. radioterapia22.

La adición de varios nanofotosensibilizadores a las microesferas Y-90 dio como resultado una generación sustancial del radical de oxígeno singlete altamente tumoricida, lo que indica que este radionúclido puede ser una fuente potencial de PDT con una variedad de compuestos activables por luz en la naturaleza. Esto concuerda con los modelos y simulaciones realizados por otros que predicen que Y-90 puede ser una fuente de luz Cerenkov ideal para PDT36,37. También agrega y amplía los hallazgos de Hartl et al. quienes mostraron una mayor citotoxicidad cuando las células de glioma y cáncer de mama fueron tratadas con el fotosensibilizador TPPS2a e Y-90 en su forma de sal (Y-90Cl3)38. El aumento dependiente del tiempo en la generación de radicales hidroxilo cuando se combinaron nanofotosensibilizadores con microesferas Y-90 hasta 72 h está en consonancia con su vida media relativamente larga de 64,1 h, y es concebible que se produzcan ROS tumoricidas aún mayores y eficaces. realizado en el escenario clínico de radioembolización de tumores hepáticos donde la vida media efectiva del Y-90 es mucho mayor que su vida media física.

Contrariamente a las observaciones en medios libres de células, la presencia de Y-90 solo sin nanofotosensibilizador dio como resultado la generación de radicales hidroxilo y superóxido mitocondrial y la muerte celular HCC in vitro y dependía linealmente de la actividad de Y-90. Esto no es inesperado, dado que la interacción de las partículas beta de alta energía en un entorno celular probablemente da como resultado subproductos oxidativos persistentes y elevados, lo que refleja la actividad tumoricida observada con Y-90 solo en la clínica39. Curiosamente, nuestros resultados demuestran un mayor estrés oxidativo con concentraciones crecientes de TiO2-Tf-TC tanto en un nivel amplio con una mayor producción de radicales hidroxilo celular como específicamente a nivel mitocondrial con una mayor producción de superóxido mitocondrial en las células SNU-387 poco diferenciadas. Si bien ambos productos oxidativos son hasta cierto punto inespecíficos dadas las vías oxidativas celulares complejas y convergentes, concuerda con observaciones previas de que las mitocondrias son un objetivo terapéutico de la PDT40. Es importante destacar que hubo una viabilidad significativamente menor en las actividades Y-90 que no eran tóxicas para ambas líneas celulares de HCC in vitro solas. Esta baja actividad (0,1 a 0,2 MBq/0,2 ml) corresponde aproximadamente a 25 a 50 Gy suponiendo el modelo MIRD y está muy por debajo de la prescrita clínicamente para volúmenes de hígado con tumores. Con el potencial de administración selectiva e internalización de nanofotosensibilizadores a células tumorales in vivo, esto puede proporcionar una acción tumoricida en áreas que reciben dosis más bajas de Y-90 debido a la heterogeneidad de la deposición de microesferas o en pacientes que no pueden recibir dosis más altas debido a mayor riesgo de toxicidades hepáticas de fondo o conductos vasculares menos favorables41. Además, se observa un aumento de la muerte celular de SNU-387 en actividades de Y-90 de hasta 0,75 MBq/0,2 ml, lo que corresponde aproximadamente a 170 Gy según el modelo MIRD, también por debajo de la dosis absorbida del volumen hepático perfundido considerada para fines ablativos en HCC7 ,8,42. Por lo tanto, la implementación de TiO2-Tf-TC u otros nanofotosensibilizadores que exhiben retención tumoral posiblemente podría reducir este umbral de dosis ablativa para el CHC y puede mostrar una mayor actividad contra tumores que requieren dosis más altas para responder12. Es importante destacar que la adición de TiO2-Tf-TC no aumentó el estrés oxidativo ni la muerte celular en hepatocitos humanos normales. Junto con el perfil de biodistribución favorable de TiO2-Tf-TC demostrado en trabajos anteriores que muestran una deposición mínima fuera del objetivo en el pulmón o en el hígado de fondo, anticipamos una baja probabilidad de que esta nueva estrategia de tratamiento aumente el perfil de toxicidad de Y-9018.

No observamos un aumento significativo en la producción celular de ROS y la citotoxicidad al agregar nanofotosensibilizadores con actividades más altas de Y-90 (por encima de 0,2 MBq/0,2 ml) en la línea celular HepG2 bien diferenciada, lo que contrasta con lo observado en la línea celular pobremente diferenciada. Línea celular SNU-387. Sin embargo, las células HepG2 eran más sensibles a los efectos citotóxicos del Y-90 solo en comparación con las células SNU-387. Estas dos observaciones pueden indicar que puede haber menos margen para mejoras terapéuticas mediante la introducción de terapias complementarias como nanofotosensibilizadores en la línea celular HepG2, más sensible. Si bien estos resultados deben confirmarse en un mayor número de muestras, datos clínicos limitados han demostrado que los pacientes con tumores de CHC de grado histológico menos diferenciados, como lo indica la tomografía por emisión de positrones (PET)/TC con doble trazador FDG/acetato C-11, tenían tasas de respuesta y supervivencia más pobres después de la radioembolización con Y-90 que sus homólogos bien diferenciados12. El aumento del estrés oxidativo y la citotoxicidad de las células SNU-387 poco diferenciadas con nanofotosensibilizadores indica que esta nueva terapia complementaria puede ejercer mayores beneficios terapéuticos con ciertos subtipos histológicos, que pueden tener ya una necesidad crítica de opciones terapéuticas adicionales. Estos hallazgos y la heterogeneidad genética sustancial del CHC también exigen un diseño cuidadoso de estudios in vivo que utilicen diferentes modelos animales ortotópicos y xenoinjertos derivados de pacientes de diferentes potenciales malignos y perfiles genéticos para capturar qué cohortes de pacientes pueden beneficiarse43. Esto será fundamental para informar y diseñar ensayos clínicos adecuadamente.

En cuanto a la implementación de PDT independiente de la profundidad con Y-90, el uso de su forma de microesferas (SirSpheres) es ventajoso ya que ya se usa ampliamente en la clínica en todo el mundo, evitando la necesidad de innovar y volver a traducir la fuente emisora beta con métodos a menudo costosos y elaborados. radioquímica. Además, mostramos que la activación de los nanofotosensibilizadores se logra cuando lo más probable es que el Y-90 permanezca extracelular (el diámetro medio de SirSphere es de 35 μm, con el Y-90 permanentemente incrustado dentro de la microesfera de resina evitando la lixiviación), probablemente como resultado de su alta energía de desintegración. (media 0,94 MeV, máximo 2,28 MeV) y penetración tisular de partículas beta-menos de 2 a 11 mm (media 2,5 mm)44. Esto evita la necesidad de reformular el Y-90 para que se internalice en las células cancerosas, lo que probablemente sea necesario para permitir la activación de nanofotosensibilizadores con otros radionucleidos de menor energía o penetrancia18. Por lo tanto, los esfuerzos de traducción clínica pueden centrarse en la formulación de nanofotosensibilizadores y pueden combinarse más fácilmente con el flujo de trabajo clínico de microesferas Y-90 ampliamente implementadas, ya sea en forma de resina o vidrio. El uso de TiO2 y TC como nanofotosensibilizadores es ventajoso ya que ambos absorben luz en el rango UV donde la emisión de Cerenkov es más alta y más eficiente, y el primero es menos susceptible al fotoblanqueo observado con fotosensibilizadores orgánicos45,46,47,48. Además, el TiO2 es un fotosensibilizador capaz de producir de forma regenerativa radicales hidroxilo y oxígeno singlete18,49. Este efecto puede iniciarse mediante la irradiación de TiO2 con radiación de espectro UV dentro de 250 a 350 nm producida por la emisión de Cerenkov de la desintegración del Y-90. La abundancia relativa de oxígeno singlete y radicales hidroxilo depende del tamaño de la nanopartícula de TiO2 y de la disponibilidad de O2, favoreciéndose el hidroxilo en un ambiente hipóxico50. Sin embargo, nuestra demostración de una producción mejorada de ROS con una variedad de fotosensibilizadores, incluida la hipericina natural y utilizada clínicamente (Figs. 2A y 3A), justifica la exploración de formulaciones de nanofotosensibilizadores adicionales. De acuerdo con trabajos anteriores, TiO2-Tf-TC se internaliza en células HCC in vitro, donde es probable que la PDT sea más eficaz y, en última instancia, puede mejorar espacialmente la actividad tumoricida de las microesferas Y-9018,51,52. Sin embargo, se necesitan estudios que examinen la absorción y retención de nanofotosensibilizadores durante un período de tiempo suficiente de la desintegración del Y-90 en modelos ortotópicos in vivo clínicamente relevantes de CHC.

El uso y manejo de microesferas Y-90 (SirSpheres) para experimentos in vitro presenta desafíos logísticos sustanciales debido a sus altos riesgos energéticos, heterogeneidad y sedimentación de microesferas, lo que requiere equipos especializados y aprobaciones de seguridad radiológica. Estos peligros resultaron prohibitivos para ciertos ensayos que involucraban luminiscencia en actividades más altas del Y-90, citometría de flujo y fueron un desafío para los estudios de microscopía, ya que el Y-90 tuvo que desintegrarse por completo (más de 30 días) antes del análisis. La sedimentación y la heterogeneidad de las microesferas se controlaron determinando la luminiscencia de fondo de cada condición experimental para estudios celulares y normalizando a una curva estándar de luminiscencia a actividad generada con Y-90-Cl3. Sin embargo, la heterogeneidad espacial invariablemente presente de las microesferas Y-90 en nuestras condiciones experimentales refleja supuestos de trabajo comunes de la microdosimetría de microesferas en la práctica actual14.

Los datos in vitro de este estudio proporcionan motivación para investigar la activación de microesferas Y-90 de nanofotosensibilizadores en modelos de CHC in vivo clínicamente relevantes. Dados los diferentes efectos en dos líneas celulares de CHC de diferente potencial maligno y etiología del cáncer, se deben priorizar los modelos in vivo con subtipos de tumores más agresivos y xenoinjertos derivados de pacientes de naturaleza similar que pueden ser más resistentes a la terapia con Y-90. Dado que la administración de microesferas Y-90 a través de la arteria hepática en animales pequeños requiere muchos recursos y es un gran desafío técnico, los esfuerzos para seleccionar el modelo in vivo correcto y más informativo son de importancia crítica. Estos esfuerzos están en curso. Si bien demostramos un mayor estrés oxidativo celular y muerte en células HCC in vitro en comparación con las microesferas Y-90 solas, esta diferencia fue más modesta en comparación con la observada en nuestros resultados de medios libres de células y en comparación con los radionucleidos emisores de positrones beta que no exhiben citotoxicidad en actividades relevantes solas en otros estudios18,20,22,23. Sin embargo, anticipamos que los efectos terapéuticos de las microesferas Y-90 combinadas con nanofotosensibilizadores serán aún más evidentes in vivo y en la clínica debido a los mecanismos tumoricidas multidimensionales de la TFD, como el cierre microvascular y la generación de muerte celular inmunogénica, que no son capturados en experimentos in vitro19. Además, no evaluamos las diferencias en los mecanismos de muerte celular o las vías de señalización entre las microesferas Y-90 solas o combinadas con nanofotosensibilizadores, lo que probablemente sería más revelador en modelos de HCC in vivo.

En conclusión, la estimulación de nanofotosensibilizadores mediante microesferas Y-90 generó una marcada mejora de la producción de ROS en medios libres de células, lo que a su vez resultó en un mayor estrés oxidativo y muerte celular en células SNU-387 HCC altamente malignas en comparación con las microesferas Y-90 solas. . Anticipamos que estos efectos terapéuticos serán aún más evidentes in vivo y en la clínica debido a los mecanismos tumoricidas multidimensionales de la TFD, con el objetivo final de mejorar la radioembolización de Y-90 para el CHC y otros tumores hepáticos. Además, la penetración tumoral y la captación intracelular de nanofotosensibilizadores TiO2-Tf-TC pueden mejorar la actividad tumoricida espaciotemporal de las microesferas Y-90. Se están realizando aplicaciones en modelos de CHC in vivo clínicamente relevantes.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Bertot, LC & Adams, LA Tendencias en el carcinoma hepatocelular debido a la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Experto Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, 179–187 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zoller, H. & Tilg, H. Enfermedad del hígado graso no alcohólico y carcinoma hepatocelular. Metabolismo 65, 1151-1160 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bray, F. y col. Estadísticas mundiales sobre el cáncer 2018: estimaciones GLOBOCAN de incidencia y mortalidad en todo el mundo para 36 cánceres en 185 países. CA Cáncer J. Clin. 68, 394–424 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Yang, JD y cols. Una visión global del carcinoma hepatocelular: tendencias, riesgo, prevención y manejo. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 16, 589–604 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pfister, D. y col. NASH limita la vigilancia antitumoral en el CHC tratado con inmunoterapia. Naturaleza 592, 450–456 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ehrhardt, GJ & Day, DE Uso terapéutico de microesferas de 90Y. En t. J. Radiat. Aplica. Instrumento. B 14, 233–242 (1987).

Artículo CAS Google Scholar

Gabr, A. y col. Correlación de la dosis de radiación absorbida por Y90 con la necrosis patológica en el carcinoma hepatocelular: análisis multicéntrico confirmatorio en 45 explantes. EUR. J. Nucl. Medicina. Mol. Imágenes 48, 580–583 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Salem, R. y col. Radioembolización con itrio-90 para el tratamiento del CHC solitario e irresecable: el estudio LEGACY. Hepatología 74, 2342–2352 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Garín, E. et al. Enfoque de dosimetría personalizada versus estándar de radioterapia interna selectiva en pacientes con carcinoma hepatocelular localmente avanzado (DOSISPHERE-01): ensayo de fase 2, aleatorizado, multicéntrico y abierto. Lanceta Gastroenterol. Hepatol. 6, 17-29 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Salem, R. y col. Radioembolización para el carcinoma hepatocelular utilizando microesferas de itrio-90: un informe completo de los resultados a largo plazo. Gastroenterología 138, 52–64 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Spreafico, C. et al. Desarrollo de una puntuación de pronóstico para predecir la respuesta a la radioembolización con itrio-90 para el carcinoma hepatocelular con invasión de la vena porta. J. Hepatol. 68, 724–732 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Ho, CL y cols. Radioembolización con microesferas de vidrio (90)Y para carcinoma hepatocelular: importancia del pretratamiento con (11)C-acetato y (18)F-FDG PET/CT y postratamiento (90)Y PET/CT en prescripción de dosis individualizada. EUR. J. Nucl. Medicina. Mol. Imágenes 45, 2110-2121 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hermann, AL y cols. Relación de la dosis de radiación absorbida por el tumor con la supervivencia y la respuesta en el carcinoma hepatocelular tratado con radioembolización transarterial con (90)Y en el estudio SARAH. Radiología 296, 673–684 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Pasciak, AS, Bourgeois, AC y Bradley, YC Un análisis microdosimétrico de la dosis absorbida en el tumor en función del número de microesferas por unidad de volumen en radioembolización 90Y. J. Nucl. Medicina. 57, 1020-1026 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Robertson, R. y col. Imágenes ópticas de la generación de luz de Cerenkov a partir de radiotrazadores emisores de positrones. Física. Medicina. Biol. 54, N355–N365 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaffer, TM, Pratt, EC y Grimm, J. Utilizando el poder de la luz Cerenkov con nanotecnología. Nat. Nanotecnología. 12, 106-117 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pratt, EC, Shaffer, TM, Zhang, Q., Drain, CM y Grimm, J. Nanopartículas como transductores de fotones multimodales de radiación ionizante. Nat. Nanotecnología. 13, 418–426 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kotagiri, N., Sudlow, GP, Akers, WJ y Achilefu, S. Rompiendo la dependencia profunda de la fototerapia con radiación Cerenkov y nanofotosensibilizadores que responden a baja radiación. Nat. Nanotecnología. 10, 370–379 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dolmans, DE, Fukumura, D. y Jain, RK Terapia fotodinámica para el cáncer. Nat. Rev. Cáncer 3, 380–387 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kotagiri, N. y col. Los radionucleidos transforman la quimioterapia en fototerapia para el tratamiento preciso del cáncer diseminado. Nat. Comunitario. 9, 275 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Tang, R. y col. Nanofotosensibilizador osteotrópico radiomarcado para obtener imágenes y tratar el mieloma múltiple. ACS Nano 14, 4255–4264 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duan, D. y col. Activación de nanopartículas de TiO2: el galio-68 sirve como emisor de fotones de alto rendimiento para la terapia fotodinámica inducida por Cerenkov. Aplicación ACS. Madre. Interfaces 10, 5278–5286 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kamkaew, A. y col. Terapia fotodinámica inducida por radiación de Cerenkov utilizando nanopartículas de sílice mesoporosas huecas cargadas con cloro e6. Aplicación ACS. Madre. Interfaces 8, 26630–26637 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beattie, BJ y cols. Modelado cuantitativo de la eficiencia de producción de luz de Cerenkov a partir de radionucleidos médicos. PLoS One 7, e31402 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luksiene, Z., Kalvelyte, A. y Supino, R. Sobre la combinación de terapia fotodinámica con radiaciones ionizantes. J. Fotoquímica. Fotobiol. B 52, 35–42 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, GD y cols. Terapia fotodinámica inducida por rayos X: una combinación de radioterapia y terapia fotodinámica. Teranóstica 6, 2295–2305 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mukerji, R. y col. Depósito intratumoral controlado espaciotemporalmente por fotorradiación para una combinación de braquiterapia y terapia fotodinámica para tumores sólidos. Biomateriales 79, 79–87 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, C. y col. Unión de centelleador y semiconductor para radioterapia sincrónica y terapia fotodinámica profunda con disminución de la dependencia de oxígeno. Angélica. Química. En t. Ed. ingles. 54, 1770-1774 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Caruso, S. et al. El análisis de líneas celulares de cáncer de hígado identifica agentes con probable eficacia contra el carcinoma hepatocelular y marcadores de respuesta. Gastroenterología 157, 760–776 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gill, RK, Mitchell, GS y Cherry, SR Rendimientos de luminiscencia de Cerenkov calculados para radionucleidos utilizados en biología y medicina. Física. Medicina. Biol. 60, 4263–4280 (2015).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Bancirova, M. Azida de sodio como inhibidor específico del oxígeno singlete durante la detección quimioluminiscente mediante análogos de luminol y Cypridina luciferina. Luminiscencia 26, 685–688 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, Q. y col. Nanoplataforma de luminiscencia persistente radioyodada para radioterapia y terapia fotodinámica inducida por radiación. Adv. Saludc. Madre. 10, e2000802 (2021).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Adachi, M. y col. La sobreexpresión del receptor 1 de transferrina se asocia con la desdiferenciación tumoral y actúa como un indicador pronóstico potencial del carcinoma hepatocelular. Histopatología 75, 63–73 (2019).

Artículo PubMed Google Scholar

Golla, K., Cherukuvada, B., Ahmed, F. y Kondapi, AK Eficacia, seguridad y actividad anticancerígena de la administración de doxorrubicina basada en nanopartículas proteicas mediante administración intravenosa en ratas. PLoS One 7, e51960 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Yoshihiro, K., Hasko, G. y Pacher, P. Detección cuantitativa simple de la producción de superóxido mitocondrial en células vivas. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 358, 203–208 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hirschberg, H. y col. Terapia fotodinámica de tasa de fluencia ultrabaja: simulación de la luz emitida por el efecto Cerenkov. en Técnicas Ópticas en Neurocirugía, Neurofotónica y Optogenética (2014).

Glaser, AK, Zhang, R., Andreozzi, JM, Gladstone, DJ & Pogue, BW Estimaciones de la fluencia de radiación de Cherenkov en tejidos para aplicaciones de terapia e imágenes moleculares. Física. Medicina. Biol. 60, 6701–6718 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hartl, BA, Hirschberg, H., Marcu, L. y Cherry, SR Activación de la terapia fotodinámica in vitro con radiación Cerenkov generada a partir de itrio-90. J. Medio Ambiente. Patol. Toxico. Oncol. 35, 185-192 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, MR y Nedrow, JR Terapia radiofarmacéutica en el cáncer: avances y desafíos clínicos. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 19, 589–608 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dougherty, TJ y cols. Terapia fotodinámica. J. Natl. Instituto de Cáncer. 90, 889–905 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fox, RA y cols. Distribución de dosis después de la radioterapia interna selectiva. En t. J. Radiat. Oncol. Biol. Física. 21, 463–467 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mazzaferro, V. et al. Radioembolización con itrio-90 para el carcinoma hepatocelular intermedio-avanzado: un estudio de fase 2. Hepatología 57, 1826–1837 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Aliado, A. et al. Caracterización genómica integral e integradora del carcinoma hepatocelular. Celda 169, 1327-1341 e1323 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Westcott, MA, Coldwell, DM, Liu, DM y Zikria, JF El desarrollo, la comercialización y el contexto clínico de microesferas de vidrio y resina radiomarcadas con itrio-90. Adv. Radiación. Oncol. 1, 351–364 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumar, SG y Devi, LG Revisión sobre fotocatálisis de TiO2 modificada bajo luz UV/visible: resultados seleccionados y mecanismos relacionados sobre la dinámica de transferencia de portadores de carga interfacial. J. Física. Química. A 115, 13211–13241 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Davidenko, N., García, O. & Sastre, R. La eficiencia del titanoceno como fotoiniciador en la polimerización de formulaciones dentales. J. Biomater. Ciencia. Polimero. Ed. 14, 733–746 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Potter, WR, Mang, TS y Dougherty, TJ La teoría de la dosimetría de la terapia fotodinámica: consecuencias de la fotodestrucción del sensibilizador. Fotoquímica. Fotobiol. 46, 97-101 (1987).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gilson, RC, Black, KCL, Lane, DD y Achilefu, S. El nanofotosensibilizador híbrido de TiO2-rutenio produce sinérgicamente especies reactivas de oxígeno en condiciones hipóxicas y normóxicas. Angélica. Química. En t. Ed. ingles. 56, 10717–10720 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Linsebigler, AL, Lu, G. & Yates, JT Fotocatálisis en superficies de TiO2: principios, mecanismos y resultados seleccionados. Química. Rev. 95, 735–758 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Lane, DD y cols. Efectos de la dimensión del cristal de titanio del núcleo y la fase cristalina sobre la generación de ROS y la acumulación tumoral de nanoagregados de dióxido de titanio recubiertos de transferrina. RSC Adv. 10, 23759–23766 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Srivatsan, A. et al. Efecto de la quiralidad sobre la captación celular, la obtención de imágenes y la terapia fotodinámica de fotosensibilizadores derivados de la clorofila-a. Bioorg. Medicina. Química. 23, 3603–3617 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilson, RC, Tang, R., Gautam, KS, Grabowska, D. y Achilefu, S. El tráfico de una sola molécula fotosensibilizante a diferentes orgánulos intracelulares demuestra una terapia fotodinámica mediada por radicales hidroxilo eficaz en el retículo endoplásmico. Bioconjugador. Química. 30, 1451-1458 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Los autores desean agradecer a José García, MS en Oncología Radioterápica y a Daniel Szatkowski de Seguridad Radiológica por su ayuda con el manejo y transferencia de SirSphere, y al Dr. Terence Gade, PhD, por el generoso obsequio de las células SNU-387. Agradecemos a Greg Williams por su ayuda en la revisión del manuscrito. Este trabajo fue financiado por las becas de investigación de la Fundación de Educación y Investigación de la Sociedad Radiológica de América del Norte (RSNA) (RSCH2115) y las subvenciones Seed (RS6409).

Departamento de Radiología, Instituto Mallinckrodt de Radiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, 4515 McKinley Ave., Piso 2, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Christopher D. Malone, Christopher Egbulefu, Alexander Zheleznyak, Jahnavi Polina, Partha Karmakar, Kvar Black, Monica Shokeen y Samuel Achilefu

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, EE. UU.

Mónica Shokeen y Samuel Achilefu

Departamento de Bioquímica y Biofísica Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Samuel Achilefu

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

CM, CE, KB y SA concibieron el concepto de investigación y el diseño experimental. CM, CE, JP, PK y KB realizaron los experimentos. CM, CE, JP, AZ, KB, MS y SA analizaron y revisaron los datos. CM escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Christopher D. Malone.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Malone, CD, Egbulefu, C., Zheleznyak, A. et al. Activación de nanofotosensibilizadores por microesferas Y-90 para mejorar el estrés oxidativo y la muerte celular en el carcinoma hepatocelular. Informe científico 12, 12748 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17185-0

Descargar cita

Recibido: 27 de abril de 2022

Aceptado: 21 de julio de 2022

Publicado: 26 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17185-0

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.

Blog