Enfoque de flujo hidrodinámico 3D simplificado para laboratorio

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14671 (2023) Citar este artículo

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El control preciso de la posición de un fluido y una partícula dentro de una plataforma de laboratorio en un chip es un requisito previo crítico para muchos procesos de análisis posteriores, como la detección, captura y separación, moviendo la detección al nivel de una sola partícula. Con el desarrollo de la tecnología de fabricación de microfluidos, el enfoque de partículas/células ha pasado de dos a tres dimensiones. El enfoque hidrodinámico 3D, que clasifica y alinea la nube entrante de partículas para que pasen una por una por el área de interrogación, permite nuevas posibilidades y avances en el sistema de análisis unicelular. A pesar de los excelentes resultados mostrados en la literatura, todavía falta un dispositivo que pueda cumplir simultáneamente los requisitos de alto rendimiento, compacidad, alta integrabilidad y facilidad de uso para convertirse en un centro de trabajo ampliamente aceptado para la investigación biomédica y aplicaciones clínicas. Aquí, propusimos un dispositivo microfluídico de enfoque de flujo 3D único enterrado en un sustrato de sílice fundida que potencialmente combina todas estas ventajas. Al diseñar un canal de muestra suspendido dentro de un canal amortiguador más grande, fabricado mediante la técnica de micromáquina asistida por láser, se muestra una capacidad de enfoque que no depende del tamaño. Se ha obtenido con alta precisión un flujo central espacial y temporalmente estable de una mezcla de partículas de PS de 15 μm y 6 μm en una solución de microesferas de PS de 1 μm. Finalmente, para probar la resolución de enfoque alcanzable, se probó el chip para la detección de la bacteria Escherichia Coli en solución acuosa como prueba de concepto de aplicación biológica.

La manipulación precisa de fluidos a bordo de plataformas microfluídicas ha despertado en los últimos años la atención del campo de investigación Lab-On-a-Chip (LOC), debido a la amplia gama de aplicaciones que pueden implementarse. Además de reducir drásticamente la cantidad de procesamiento de muestras y reducir el tamaño de los instrumentos a una escala portátil, la capacidad de controlar con precisión la posición de un fluido (y por lo tanto, también de las partículas que fluyen en él) dentro de dispositivos microfluídicos ha cambiado la detección en el nivel de una sola partícula. Esto mejora enormemente la sensibilidad y la cantidad de información extraíble. Múltiples campos ya se han beneficiado de estas ventajas, como el biomédico (por ejemplo, citometría de flujo y detección de partículas individuales1) o el ambiental (por ejemplo, monitoreo del cambio climático, contaminación microbiana del agua2) y la industria (cosméticos3 y pureza de alimentos y bebidas). controlar2. Las partículas que fluyen dentro de una plataforma de microfluidos, especialmente en altas concentraciones, se distribuyen aleatoriamente en la sección transversal del canal, lo que afecta drásticamente la eficiencia de cualquier paso de análisis posterior4. Por lo tanto, el principio fundamental detrás del enfoque de flujo 3D es ordenar la nube entrante de partículas, alineándolas para que crucen el área de interrogación una por una. Por lo tanto, desde esta perspectiva, el dispositivo de enfoque ideal debería tener en cuenta la presencia de uno o más pasos de análisis posteriores (por ejemplo, detección, captura y separación), y al mismo tiempo poder gestionar partículas muy pequeñas e incluso moléculas, un proceso que no depende del tamaño. La capacidad de enfoque cambia las reglas del juego. Por esta razón, los requisitos críticos que deben cumplirse son compacidad, para no afectar la portabilidad de la plataforma, alto rendimiento, para no ralentizar todo el proceso de análisis, y facilidad de uso, para que el dispositivo sea lo más automatizado y flexible posible. . Muchas estrategias diferentes ya han intentado afrontar este desafío. Principalmente, se pueden identificar dos enfoques distintos: métodos que inducen fuerzas sobre las partículas externamente (también conocidas como activas) o internamente (también conocidas como pasivas). En el primer caso, los campos de fuerza más utilizados son los acústicos5, 6, magnéticos7 y eléctricos8, 9. Aunque son métodos eficaces, la necesidad de otros estímulos externos complica tanto el proceso de fabricación, necesitando la integración de elementos como transductores piezoeléctricos, imanes , y electrodos, y la operación, requiriendo el control de la generación de fuerza además del flujo. Luego, para permitir que el campo actúe sobre la trayectoria de las partículas, es necesario limitar los caudales, lo que da como resultado rendimientos de 0,85 µL/min a unos pocos cientos de µL/min y, sólo en casos limitados, alrededor de 500 µL/min4, 6. Por otro lado, los métodos pasivos ejercen una acción de enfoque simplemente gracias a su configuración de flujo. En este caso se puede hacer otra distinción: algunos enfoques utilizan efectos sin vaina, debido a fuerzas de inercia generadas por la geometría del canal10 o por la integración de estructuras, como ranuras o pilares, en el canal11, 12, mientras que otros utilizan múltiples entradas. , de 1 a 4, para limitar el flujo de muestra13,14,15,16. La microfluídica inercial es un método atractivo ya que permite lograr altos rendimientos (hasta unos pocos ml/min)17 y no se necesitan flujos de vaina, lo que reduce la complejidad operativa. Sin embargo, el enfoque inercial tiene dificultades para mejorar la resolución de enfoque, especialmente en espacios pequeños. De hecho, es bien sabido que estos dispositivos explotan la competencia entre dos fuerzas que actúan sobre las partículas que fluyen y que están fuertemente relacionadas con su tamaño: las fuerzas de sustentación inducidas por cizallamiento y las fuerzas de sustentación inducidas por la pared17. Por tanto, para lograr la concentración del flujo es necesario utilizar sólo un diámetro de partícula a la vez. Además, enfocar partículas cercanas a la escala (sub)micrométrica encuentra dificultades, ya que la longitud mínima del microcanal requerida para un enfoque efectivo aumenta dramáticamente a medida que disminuye el tamaño de las partículas, lo que afecta la compacidad del chip y complica la integración de pasos de análisis adicionales. En canales rectos, la geometría y la longitud de enfoque varían dependiendo del diámetro de las partículas10, 18,19,20,21, mientras que en el caso de canales espirales22, 23 o conjuntos de contracción-expansión24, al usar una mezcla de diferentes tamaños, se obtienen diferentes equilibrios. Los puntos se establecen en diferentes posiciones a lo largo de la sección del canal. Esto da como resultado múltiples flujos enfocados que no son adecuados para una única región de interrogación. Luego, se observan efectos de inercia cuando la fracción de volumen de las partículas es inferior al 1%, para evitar que las interacciones entre partículas interrumpan el enfoque25. Esto significa que la muestra debe diluirse, lo que disminuye el rendimiento efectivo y requiere un paso de preprocesamiento adicional. La forma conceptualmente más sencilla de confinar el flujo de muestra en el centro de un canal de microfluidos, independientemente del tamaño de las partículas, es inyectar otros cuatro flujos dentro del mismo canal. Muchos trabajos han implementado dicha estrategia, logrando buenos resultados de enfoque14, 16, 26, 27, pero aún la necesidad de gestionar cinco (o seis) entradas simultáneamente no facilita el uso del dispositivo en aplicaciones clínicas. Por este motivo, varios grupos han presentado soluciones interesantes para reducir el número de puertos de inyección. Una de las estrategias más utilizadas es dividir un ramal original antes de conectarlo al canal principal, disminuyendo el número de entradas en dos13, 28, 29. Además de la reducida complejidad en el funcionamiento de estos dispositivos, el flujo debe dividirse con precisión en todas las ramas para alcanzar un posicionamiento preciso de las partículas. Por tanto, aumenta el riesgo de introducir asimetrías en la manipulación del fluido o en la geometría, durante los procesos de fabricación o en el funcionamiento experimental (por ejemplo, debido a una burbuja de aire). Tripathi et al.30 han logrado una geometría simplificada con sólo dos entradas y sin división, que explota la combinación de un flujo amortiguador y el efecto de vórtice Dean debido a los canales curvos. Además de la buena eficiencia de enfoque, los rendimientos están limitados a 100 µL/min. En cambio, algunos otros trabajos han llegado a un equilibrio al utilizar dos entradas de vaina y reducir la relación de aspecto del canal de muestra, de modo que el flujo amortiguador envuelva el flujo principal en la unión31, 32. Sin embargo, también estos dispositivos muestran un rendimiento limitado que varía desde µL/min hasta 30 µL/min, principalmente debido a la deformabilidad del polidimetilsiloxano (PDMS), del que están hechos. En cambio, Patel et al.33 han utilizado una estrategia similar, pero el caudal de su dispositivo no está limitado gracias al microfresado de polimetacrilato de metilo (PMMA). Sin embargo, dado que sus partículas concentradas fluyen hacia el fondo del canal principal, el dispositivo está expuesto a riesgos de obstrucción. Otras soluciones creativas están representadas por intentos de rodear un canal principal con entradas de amortiguación, integrando dos micropipetas34, varios microcapilares35 o una microboquilla36. Además de la elegante implementación, los dispositivos son muy frágiles y las prestaciones están estrictamente ligadas a la precisión del proceso de fabricación.

En este trabajo presentamos una red de microfluidos para el posicionamiento preciso de partículas en el centro del canal principal, aprovechando solo dos entradas (muestra y flujo de envoltura), que tiene como objetivo cumplir los requisitos, es decir, facilidad de uso, altos rendimientos. y compacidad, para impulsar la integrabilidad de la plataforma. El diseño del dispositivo se estudia mediante simulaciones numéricas y luego se fabrica enterrado en un sustrato de sílice fundida gracias a la alta versatilidad de la irradiación láser de femtosegundo, seguida de la técnica de grabado químico (FLICE)37,38,39,40,41. Además de sus grandes capacidades 3D, esta conocida técnica también ofrece la posibilidad de integrar otros elementos de análisis, como elementos ópticos42, fibras ópticas y electrodos43, abriendo el camino a la fabricación de un sistema de análisis micro total (μTAS) completamente integrado para aplicaciones biológicas. El elemento de enfoque hidrodinámico se caracterizó alineando microperlas de poliestireno (PS) entrantes con diferentes tamaños. Para probar la resolución de enfoque alcanzable, se realiza una prueba de concepto utilizando este elemento para detectar ópticamente la presencia de bacterias en una muestra de agua.

Para lograr un enfoque hidrodinámico 3D preciso, es necesaria la presencia de un flujo de vaina confinado. Por lo tanto, debido a las limitaciones de las técnicas de fabricación actuales de redes de microfluidos, la única forma de reducir un flujo central con un fluido amortiguador es dejar que se fusionen en un punto determinado creando una unión de múltiples ramas (Fig. 1a). Por tanto, tanto el proceso de fabricación, que requiere especial atención para no introducir asimetrías en la geometría, como el funcionamiento, que requiere el control de otros cuatro flujos, son muy complejos. En efecto, cualquier desequilibrio, debido a la geometría, a la diferente viscosidad del flujo o a la obstrucción de una de las ramas, conduce a una alteración del enfoque o a una alineación no precisa. Para evitar esto, diseñamos una geometría única que encierra una entrada de muestra dentro de un canal de amortiguación (Fig. 1b), en un sustrato indeformable (sílice fundida). Al explotar las capacidades de la técnica de fabricación FLICE, fue posible diseñar el canal de muestra 3D bien alineado a lo largo del eje del canal de vaina 3D (Fig. 1c, d), asegurando un posicionamiento preciso del flujo enfocado en el centro de la salida. . De esta manera, gracias a la laminaridad, el flujo de muestra se limita naturalmente al requerir una única corriente de tampón.

(a) La estrategia más utilizada para lograr un enfoque hidrodinámico 3D es confinar el flujo central dentro de cuatro flujos envolventes. Por tanto, la complejidad tanto del proceso de fabricación como del funcionamiento de dichos dispositivos aumenta considerablemente. (b) La geometría diseñada presenta solo dos canales de entrada, uno anidado dentro del otro. De esta manera, la corriente tampón confina naturalmente el flujo de muestra en el centro del canal de salida y con él todos los participios, independientemente de su tamaño. (c) vista en el plano xy del dispositivo presentado. El canal de muestra se coloca en el medio del canal de la funda, por lo que el flujo de salida se alinea automáticamente en el centro de la salida. Esto también es válido para el plano zx (d).

Se han realizado simulaciones numéricas (COMSOL Multiphysics 5.3a) para visualizar la configuración de flujo de dicha geometría e introducir algunas optimizaciones. Por ejemplo, para garantizar la robustez del chip y la simetría 3D de los distintos flujos, los mejores resultados se obtuvieron con la geometría que se muestra en la Fig. 2. El canal de muestra, con una curva pronunciada, está sostenido por un soporte de sílice fundida sin grabar que contiene él, modelado en forma de “T”. Se añadió una expansión esférica de 200 μm de radio a la unión de los dos canales para garantizar la simetría. De esta manera, el fluido puede reorganizarse de manera más uniforme alrededor del obstáculo "T" con una distribución de velocidad más uniforme (Fig. 2a) y un flujo enfocado más estrecho (Fig. 2b). Para todas las simulaciones se ha utilizado una solución híbrida para la malla: malla gruesa en las áreas de menor interés (por ejemplo, los tubos de conexión), malla fina para el canal de 200 µm y malla súper fina para toda la esfera y el área de enfoque hidrodinámico.

(a) Mapa de velocidad de flujo de los canales de microfluidos en los planos xy y zx, obtenido con presiones de entrada de muestra de 90 mbar y 190 mbar para la entrada de la vaina. La presencia del canal de muestra actúa como un obstáculo, pero gracias a su forma de "T" y la expansión esférica, el perfil de flujo aguas abajo da como resultado una distribución uniforme de la velocidad del fluido tanto en el plano xy como en el zx. (b) La ampliación esférica también proporciona al dispositivo un comportamiento de enfoque más potente, lo que da como resultado un flujo enfocado más estrecho.

Finalmente, las simulaciones también han mostrado (Fig. 2b) cómo es posible reducir aún más el ancho de la corriente confinada al reducir las dimensiones del canal de salida. Por lo tanto, la geometría final que se ha fabricado se compone de todos los canales de sección rectangular, donde la entrada del buffer tiene una sección transversal de 200 μm × 200 μm, la entrada de muestra de 50 μm × 50 μm y la salida de 120 μm × 120 μm. . La longitud total de los canales es de sólo 1,7 mm, lo que da como resultado un dispositivo muy compacto.

La geometría propuesta tiene el potencial de lograr un enfoque hidrodinámico 3D completo en un solo paso de escritura, lo que da como resultado un dispositivo muy compacto y fácilmente operable. A diferencia de otras tecnologías de microfabricación en materiales blandos, la capacidad y resolución espacial que ofrece la técnica FLICE permitió fabricar una estructura muy compleja de forma rápida y robusta (Fig. 3a). El canal de muestra está suspendido en el centro del flujo de amortiguación durante casi 500 µm. No hemos experimentado ningún problema de inestabilidad gracias a sus paredes de 30 µm de espesor conectadas directamente al material a granel. No se requiere ningún procedimiento de sellado o recocido para evitar debilidades mecánicas y fugas de fluido. Para visualizar el flujo enfocado se han realizado pruebas de caracterización inyectando agua desionizada en el canal tampón y una solución base agua teñida de azul (Fig. 3b). El ancho del canal se midió utilizando un objetivo de mayor aumento (20 ×, NA 0,45) para garantizar una resolución correcta (~ 1 µm).

(a) Imagen de estereomicroscopio del dispositivo con el tubo PEEK insertado y listo para funcionar. (b) Imagen de microscopio óptico (aumento de 5 ×) del dispositivo durante los experimentos de caracterización del flujo (presión de entrada de entrada de muestra de 80 mbar y presión de entrada de la vaina de 110 mbar). Los anchos de los canales se midieron en otra imagen (no mostrada) adquirida con un objetivo de mayor aumento (20 ×, NA 0,45, resolución ~ 1 µm). (c) Sección transversal simulada de la condición de enfoque hidrodinámico en la salida (muestra de Pinlet = 80 mbar; vaina de Pinlet = 110 mbar). El área roja más externa (región de puntos rojos dispersos) es un artefacto de la simulación debido a las condiciones antideslizantes de las paredes, mientras que el área azul de 16 μm × 16 μm es la sección transversal de la muestra. ( d ) Sección transversal experimental obtenida en función de la presión de la vaina de entrada. La presión de entrada se ha fijado en 80 mbar, mientras que la presión de entrada del tampón se ha escaneado en pasos de 20 mbar, empezando de 60 a 160 mbar. Los resultados en casos de vaina Pinlet < 80 mbar no se muestran, ya que no se ha observado ninguna focalización del flujo debido al desventajoso par de presión. La corriente confinada muestra buena simetría y el valor más estrecho alcanzado es de 9 μm × 5 μm, para los planos xy y zx, respectivamente. Como se destaca en el estudio de caso (Fig. 3b y datos de puntos con un asterisco), la prueba experimental validó las simulaciones numéricas, lo que resultó en una dimensión similar y un flujo enfocado simétrico 3D.

Debido a la extrema compacidad del dispositivo -con una longitud total de 2 mm y una longitud de sección de enfoque de 0,62 mm- no se han observado mecanismos de difusión y el flujo procedente de la entrada de muestra se ha contraído correctamente, tanto en sentido horizontal como en sentido vertical. dirección vertical uniformemente, coincidiendo con las dimensiones obtenidas por las simulaciones numéricas (Fig. 3c, se informan más detalles sobre esta simulación en la sección Material y Método). La relación entre la muestra y las presiones de entrada de la vaina se investigó eligiendo una presión razonable para la primera (80 mbar) y luego variando la segunda en pasos de 20 mbar (Fig. 3d). Como se esperaba, cuando el flujo de la vaina se inyecta con una presión inferior a la de la entrada de la muestra, no se observa ninguna concentración del flujo. En cambio, cuando se acerca al mismo valor, comienza a aparecer un leve efecto de enfoque. Esto puede explicarse por la diferencia en la sección transversal de los dos canales (entrada de muestra: 50 µm × 50 µm, entrada de buffer: 200 µm × 200 µm) que permite que el flujo de la funda alcance velocidades más altas, además de la misma presión de inyección. . Luego, al comenzar a crear un desequilibrio entre las dos presiones, a favor de la entrada de la vaina, el flujo de muestra se vuelve cada vez más confinado. Dado que el canal de muestra está centrado a lo largo del eje del canal de la funda, la contracción se coloca en el medio de la sección transversal del canal de salida. Al aumentar la presión de la vaina en más del doble de la entrada de la muestra, la corriente enfocada desaparece, ya que el fluido tampón crea una pared virtual en la salida del canal de la muestra, bloqueando el flujo entrante. Se puede observar cómo el flujo enfocado presenta una buena simetría, mostrando tamaños similares tanto en el plano xy como en el plano zx, excepto por el mayor desequilibrio, donde la dimensión en el plano xy es ~ 9 µm mientras que es 5 µm en el otro plano. Cabe apreciar cómo el dispositivo es capaz de alcanzar valores de enfoque comparables a los de la literatura, pero con mucha menos complejidad tanto en el proceso de fabricación como en el funcionamiento (sólo se necesitan dos canales de entrada). Esto sugiere que el potencial de enfoque de esta geometría puede incluso ampliarse más, por ejemplo, reduciendo el diámetro de la entrada de la muestra.

Dado que la aplicación objetivo de nuestro dispositivo es la alineación de partículas antes de cruzar un área de interrogación para el análisis de una sola partícula, también se han llevado a cabo experimentos de enfoque de perlas de PS. En una aplicación ideal, dicho elemento debería presentar una buena versatilidad, siendo capaz de centrar partículas de varios tamaños, sin necesidad de modificar ni el flujo ni la geometría, a diferencia de lo que ocurre en las técnicas basadas en la inercia18. Para comprobar esta cualidad, hemos probado nuestro dispositivo utilizando una mezcla de partículas a base de agua (con diámetros de 15 µm y 6 µm) y hemos establecido la dimensión de enfoque en un tamaño de partícula mayor, manteniéndolo constante. La Figura 4 muestra el resultado obtenido: diferentes partículas se enfocan correctamente a lo largo del eje central del canal de salida, tanto en el plano xy como en el plano zx (Fig. 4, recuadro). Como se puede apreciar mediante el análisis del perfil de línea, las partículas que fluyen en el canal de muestra se ubican aleatoriamente a lo largo de la sección pero, después de ingresar a la región de enfoque, su distribución se centra alrededor del eje de salida, mostrando un pico mayor exactamente en el medio del canal. Lo más probable es que los ± 5 μm desde esta posición enfocada se deban a que el flujo confinado tiene una dimensión igual a las partículas más grandes. Por lo tanto, las partículas más pequeñas aún pueden ocupar posiciones distintas al centro exacto. Sin embargo, áreas de tránsito de pocas micras siguen siendo compatibles con la mayoría de las metodologías de interrogación.

Prueba de concepto del dispositivo presentado. La prueba de microfluidos se llevó a cabo inyectando una mezcla a base de agua de perlas de PS de diferentes tamaños, es decir, 15 μm y 6 μm. La imagen es una superposición de múltiples cuadros adquiridos a 10.000 fps a través de una cámara de alta velocidad, acoplada a un microscopio óptico (aumento de 10 ×). Todas las partículas están correctamente alineadas a lo largo del eje de salida en 3D (recuadro a). Las perlas se distribuyen aleatoriamente a lo largo de la sección transversal del canal de muestra (recuadro b), pero una vez que cruzan la región de enfoque, se redistribuyen en un área más estrecha (~ 10 μm) (recuadro c). Los gráficos de recuento se obtienen procesando un vídeo completo de unos 1754 fotogramas.

Para comprender mejor las potencialidades de nuestro dispositivo, no solo para alinear, sino también para separar nubes de partículas entrantes, hemos llevado los tamaños de partículas al límite procesando una solución a base de agua de perlas de 1 μm (Fig. 5). Durante la fase experimental, a partir de las condiciones de presión de entrada simuladas (muestra 90 mbar, funda 190 mbar), mejoramos aún más la capacidad de enfoque del chip con respecto a la muestra de perlas pequeñas aumentando ligeramente las presiones operativas (muestra 97 mbar, funda 194 mbar). Curiosamente, las partículas se concentran nuevamente a lo largo del eje de salida, aunque la dimensión del flujo enfocado es mayor que 1 μm. El conjunto completamente desorganizado de perlas de 1 μm en la corriente de muestra se clasifica según la región de enfoque, lo que da como resultado una distribución muy bien pico en el canal de salida (Fig. 5a). Sorprendentemente, independientemente de cuán agregadas puedan estar, las partículas, cuando se someten al flujo de enfoque, ingresan al corredor fluídico una por una (Fig. 5b). En este caso, las posiciones confinadas difieren en sólo 3 μm, lo que muestra una alineación casi perfecta.

Experimento de microfluidos del mismo dispositivo mediante la inyección de una solución a base de agua de perlas de PS de 1 μm (presión de entrada de la muestra 97 mbar y presión de entrada de la vaina 194 mbar). (a) La imagen es una superposición de múltiples cuadros adquiridos por una cámara de alta velocidad a 50 000 fps, acoplada a un microscopio óptico (aumento de 20 ×). Las partículas entrantes se distribuyen aleatoriamente en el canal de muestra y luego se alinean con precisión en el canal de salida. La precisión de la alineación es extremadamente alta, mostrando un posible desplazamiento de sólo 3 μm. Los gráficos de recuento de perfiles de líneas se obtienen procesando un vídeo de unos 2100 fotogramas. (b) Fotograma único del vídeo adquirido, que muestra que las partículas, cuando pasan por la región de enfoque, se dividen bien y se envían al canal de salida una por una.

Además, a partir de este experimento fue posible validar el mapa de velocidad del flujo obtenido mediante simulaciones numéricas (Fig. 2 a). Gracias al pequeño tamaño de las perlas se puede suponer que se mueven a la misma velocidad que el flujo. En este experimento, con presiones de entrada de muestra de 97 mbar (90 mbar simulados) y 194 mbar para la entrada de la vaina (190 mbar simulados), se midieron las partículas que fluían a una velocidad promedio de alrededor de 0,4 m/s similar al flujo en la simulación. Considerando un área de tránsito transversal de ~ 15 μm × 15 μm para el flujo de muestra (debido al enfoque), el rendimiento real obtenido (es decir, el consumo volumétrico en el tiempo de solo la muestra que se va a procesar) es de 0,35 ml/h. Sin embargo, el rango de presiones de funcionamiento se puede ampliar mucho más gracias a las sólidas propiedades mecánicas del dispositivo, alcanzando valores de entrada del orden de varios bar. En este caso, las simulaciones numéricas han demostrado que la velocidad del flujo enfocado se aproxima a valores del orden de decenas de m/s, lo que da como resultado rendimientos de decenas de ml/h. Se debe tener cuidado al utilizar fluidos de diferentes viscosidades, ya que los puntos de trabajo (Pmuestra -Pbuffer) serán diferentes de los que normalmente se muestran aquí. Sin embargo, todavía es posible identificar puntos de trabajo que logren los mismos resultados de enfoque.

Finalmente, como prueba de concepto, la sección de enfoque hidrodinámico se ha integrado en un sencillo chip fotocitómetro para la detección de la partícula. La Figura 6a muestra el boceto del dispositivo, el área de interrogación está compuesta por dos fibras ópticas (fibra monomodo para el ramal de excitación y multimodo para el ramal de recolección) colocadas una frente a la otra. Gracias a esta configuración óptica la sección del canal (transversal al flujo) ocupada por el rayo láser queda limitada a una línea estrecha de aproximadamente 5 µm de diámetro, bien situada en el centro del canal principal. Cuando la partícula pasa por delante de las fibras oscurece el haz de la sonda, induciendo una reducción de la luz recogida por la otra fibra. El rendimiento del laboratorio en un chip para dicho conteo automático está estrechamente relacionado con la capacidad de separación efectiva y el control preciso de la posición 3D de los objetos micrométricos dentro del canal. Los desplazamientos de unas pocas micras con respecto al eje óptico de detección pueden inhibir la medición, lo que respalda la importancia del concepto de enfoque desarrollado anteriormente. Para probar la resolución de enfoque alcanzable, una prueba de concepto, la validación del chip se realizó con la bacteria Escherichia Coli en una solución acuosa. Como se muestra en las figuras 6 byc, cuando la bacteria está en el área de detección, dispersa suficiente luz para ser identificada. Esta detección no tiene etiquetas y, por lo tanto, no puede distinguir una bacteria de una partícula del mismo tamaño. Sin embargo, analizando el ancho del pico es posible reconocer partículas de diferentes tamaños.

(a) Bosquejo del citómetro optofluídico para análisis de partículas individuales. Después de la zona de enfoque hidrodinámico, las partículas alineadas pasan a través de un par de fibras (zoom insertado). La dispersión del haz de la sonda debido a la partícula permite su detección. (b) Fotograma único del vídeo adquirido, que muestra una bacteria que dispersa la luz que pasa en el área de detección (muestra de Pinlet = 97 mbar; vaina de Pinlet = 194 mbar). (c) Señal típica adquirida por el fotodetector.

El análisis de micropartículas ha despertado recientemente la atención del campo de la investigación en microfluidos debido a la amplia gama de información que se puede extraer. En este contexto, la manipulación de partículas dentro de redes de microfluidos se vuelve crucial. Propusimos, fabricamos y caracterizamos con éxito un dispositivo microfluídico de enfoque de flujo 3D único enterrado en un sustrato de sílice fundida que reúne ventajas como compacidad, alta integrabilidad, alto rendimiento y operación fácil de usar. Al diseñar un canal de muestra suspendido dentro de un canal amortiguador más grande, ha sido posible obtener un enfoque hidrodinámico 3D simétrico de menos de 10 μm de ancho, utilizando solo dos entradas. Esto ha permitido confinar en un flujo central (espacial y temporalmente estable) una mezcla de partículas de PS de 15 μm y 6 μm, con una precisión de ± 5 μm y una solución de perlas de PS de 1 μm, con un error de apenas 3 μm. . La técnica de fabricación FLICE hizo posible tallar la geometría a partir de un único sustrato de sílice fundida, proporcionando al dispositivo una robustez mecánica excepcional y permitiendo así altos rendimientos. Además de sus capacidades de fabricación 3D, esta técnica también ofrece la posibilidad de integrar fácilmente elementos fotónicos autoalineados a la red de microfluidos, como elementos ópticos, fibras ópticas y guías de ondas, simplificando significativamente los pasos de fabricación.

Todas estas ventajas únicas, combinadas con su extrema compacidad (longitud total ~ 2 mm) y su comportamiento totalmente libre de obstrucciones, demuestran que el dispositivo propuesto exhibe todas las características que podrían impulsar la implementación de una plataforma totalmente microfluídica para partículas biológicas y químicas. sintiendo. De hecho, la geometría propuesta puede ser una herramienta fundamental para estudios avanzados sobre la detección altamente sensible de contaminantes en fluidos (bacterias, microplásticos, metales pesados), para el análisis de la rigidez de las células y para el estudio estadístico de todas las partículas que se pueden hacer emitir. (fluorescencia) o dispersión.

Las simulaciones numéricas se realizaron utilizando COMSOL Multiphysics 5.3a utilizando los módulos base y de microfluidos. Se utilizó una solución de malla híbrida para todas las simulaciones: malla gruesa en las áreas de menor interés (por ejemplo, los tubos de conexión), malla fina para el canal de 200 µm y malla súper fina para toda la esfera y el área de enfoque hidrodinámico. Las condiciones límite se establecieron en condiciones de no deslizamiento para las paredes de todo el chip, mientras que se aplicaron diferentes presiones a las entradas para simular el comportamiento en diferentes circunstancias. Para visualizar correctamente (Fig. 3c) la sección transversal de dos fluidos idénticos (tampón y muestra) en condiciones de flujo, se utilizó una estrategia de simulación adecuada: los dos flujos (muestra y tampón) se imitaron como un conjunto de pequeñas esferas de 50 nm. (rojo para moléculas de tampón, azul para moléculas de muestra) comenzando desde sus respectivas entradas y propagándose a través del dispositivo. Para cada entrada se liberaron 10′000 perlas, imponiendo las presiones reportadas en la captura (muestra Pinlet = 80 mbar; vaina Pinlet = 110 mbar). Las partículas se establecieron de manera que no interactuaran entre sí (llevando al exceso un fluido no viscoso), mientras que para las paredes imponemos condiciones antideslizantes. Una vez estacionaria, la sección transversal se observó a cientos de micrones de distancia de la zona de enfoque.

La técnica FLICE37,38,39,40,41 se basa en dos pasos principales: irradiación con láser de femtosegundo y grabado húmedo. El primero dota a esta técnica de fabricación de una capacidad excepcional para diseñar geometrías, incluso complejas, en 3D. El proceso aprovecha la absorción multifotónica para modificar selectivamente el material solo en el volumen puntual, alcanzando resoluciones espaciales de menos de 1 y 5 μm respectivamente en las direcciones transversal y longitudinal. Una vez expuesto al rayo láser, el material se modifica permanentemente y se crean y alinean nanoestructuras, también llamadas nanorejillas, dependiendo de la polarización de la luz41. Al ajustarlo, es posible modular la velocidad del segundo paso, un grabado químico húmedo, basado en una solución acuosa de ácido fluorhídrico (HF), con una concentración de HF del 20%. La solución química reacciona más rápidamente con el material modificado, permitiendo una remoción selectiva que conduce a la creación de estructuras huecas, a partir de un único sustrato de sílice fundida42,43,44,45. Nuestra configuración de micromecanizado consta de un sistema láser de femtosegundo Yb:KGW amplificado (Pharos, Light Conversion) con una duración de pulso de 230 fs, una longitud de onda de 515 nm (frecuencia duplicada), una frecuencia de repetición de 500 kHz enfocada con un objetivo de microscopio de 50 × —0,42 NA. (Plan-Apocromático de distancia de trabajo ultralarga M Plan Apo SL50X, Mitutoyo). Se utilizan etapas de movimiento de 3 ejes controladas por computadora (ABL-1000, Aerotech) interconectadas por software basado en CAD (ScaBase, Altechna) con un modulador acústico-óptico integrado para traducir la muestra en relación con el parche deseado de irradiación láser. Debido a la precisión necesaria para fabricar el canal interno, los parámetros se han establecido para garantizar un paso de grabado de alta velocidad, aprovechando el efecto de diferentes polarizaciones del láser y un relleno de volumen denso (con pasos de 6 a 6 μm). La irradiación láser se ha configurado para entregar una potencia promedio de 200 mW (400 nJ) sobre la muestra, escaneándola a una velocidad de 1 mm/s.

Los experimentos de microfluidos se llevaron a cabo a través de un sistema de presión de inyección controlada por Elveflow (OB1MK3), lo que garantiza una alta resolución y una regulación de presión estable. La geometría de sílice fundida se ha conectado al sistema de inyección mediante un tubo de PEEK de 150 μm de diámetro interno y 7 cm de longitud. Para poder observar los fluidos y partículas que fluyen en el dispositivo microfluídico, las pruebas se han realizado bajo un microscopio óptico (BX53M, Olympus) acoplado a una cámara de alta velocidad (FASTCAM Mini UX100 tipo 800k-M-16G, Photron). Los experimentos han requerido la grabación de vídeos a velocidades de fotogramas que oscilan entre 10.000 y 50.000 fps. Las imágenes han sido adquiridas y procesadas a través del software Photron FASTCAM Viewer 4 (PVF4) o ImageJ. Para extraer más información, se implementó y utilizó el algoritmo específico de Matlab (MATLAB, versión R201b, Natick, Massachusetts: The MathWorks Inc.).

El dispositivo ha sido diseñado para enfocar un flujo principal entrante y alinear las partículas transportadas dentro de él a lo largo del eje central del canal de salida. Se han llevado a cabo varios experimentos de caracterización. En primer lugar, se ha evaluado la configuración del flujo y se ha comparado con los resultados obtenidos mediante simulaciones numéricas. Para ello, se ha inyectado una solución de colorante azul de base acuosa en la entrada de la muestra a una presión constante de 80 mbar, mientras que por el canal de la vaina se ha hecho fluir una solución de agua desionizada variando sus presiones de 60 a 160 mbar. Luego, se investigó el comportamiento de enfoque de partículas utilizando una mezcla a base de agua de perlas de poliestireno de 15 μm y 6 μm (microesferas de látex de poliestireno (PS) 42716 y 42718, dispersión al 2,5 % en peso, Alfa Aesar) y una solución de 1 μm. partículas (peso 2,5%, Sigma-Aldrich), en dos experimentos diferentes. Finalmente al elemento de enfoque hidrodinámico se le han añadido un par de fibras ópticas (M42L01 y P1-460B-FC-1, Thorlabs) para detectar el paso de partículas por delante de ellas. Como prueba de concepto de aplicación biológica, este chip se probó para la detección de microorganismos, en particular se utilizaron bacterias de la cepa 25922 de Escherichia coli. Se utilizaron caldo Luria-Bertani (LB) y agar LB, respectivamente, para el cultivo líquido y los ensayos de crecimiento en placa. Los cultivos bacterianos líquidos se cultivaron durante la noche en medio LB en una incubadora a una temperatura constante de 37 °C, con una velocidad de agitación de 200 rpm. Antes de trasladarlos a placas de agar LB, se diluyeron hasta una DO600 de 0,5. Luego, para las pruebas en chip, se suspendieron en agua con una concentración aleatoria. En términos de tamaño, las bacterias utilizadas pueden identificarse como bastones de este tamaño nominal: diámetro de 200 a 300 nm y longitud de 1 a 2 µm.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Centro de Nanociencia y Tecnología, Instituto Italiano de Tecnología, Via Rubattino 81, 20134, Milán, Italia

Filippo Storti, Silvio Bonfadini y Luigino Criante

Departamento de Física, Politécnico de Milán, Piazza Leonardo da Vinci, 32, 20133, Milán, Italia

Filippo Storti

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Conceptualización, FS; metodología, LC; software, FS.; validación, FS, SB; análisis formal, FS, SB; investigación, FS y SB; recursos, LC; curación de datos, FS, SB; redacción: preparación del borrador original, FS; redacción: revisión y edición, SB; supervisión, LC; administración de proyectos, LC. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Luigino Criante.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Storti, F., Bonfadini, S. y Criante, L. Enfoque de flujo hidrodinámico 3D simplificado para estudio de partículas individuales en un chip. Representante científico 13, 14671 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40430-z

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Recibido: 09 de marzo de 2023

Aceptado: 10 de agosto de 2023

Publicado: 06 de septiembre de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40430-z

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