celda automatizada

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 19873 (2022) Citar este artículo

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Este estudio tuvo como objetivo clasificar automáticamente las células vivas según su tipo celular mediante el análisis de los patrones de señales retrodispersadas de las células con un efecto mínimo sobre la fisiología y la actividad celular normales. Nuestros estudios anteriores han demostrado que la detección acústica sin etiquetas utilizando ultrasonido de alta frecuencia a una alta frecuencia de repetición de pulso (PRF) puede capturar y analizar un solo objeto de una muestra heterogénea. Sin embargo, es crucial eliminar posibles errores en la configuración manual y procesos que consumen mucho tiempo al posprocesar los coeficientes de retrodispersión integrada (IB) de señales retrodispersadas. En este estudio, se propone un sistema automatizado de clasificación de tipos de células que combina una técnica de detección acústica sin etiquetas con modelos de inteligencia artificial potenciados por el aprendizaje profundo. Aplicamos un codificador automático convolucional unidimensional (1D) para eliminar el ruido de las señales y realizamos un aumento de datos basado en la inyección de ruido gaussiano para mejorar la solidez del sistema de clasificación propuesto frente al ruido. Posteriormente, las señales retrodispersadas sin ruido se clasificaron en tipos de células específicas utilizando modelos de redes neuronales convolucionales (CNN) para tres tipos de representaciones de datos de señales, incluidos modelos CNN 1D para análisis de formas de onda y espectro de frecuencia y modelos CNN bidimensionales (2D) para análisis de espectrogramas. Evaluamos el sistema propuesto clasificando dos tipos de células (por ejemplo, RBC y PNT1A) y dos tipos de microesferas de poliestireno mediante el análisis de sus patrones de señales retrodispersadas. Intentamos descubrir las propiedades físicas de las células reflejadas en señales retrodispersadas controlando variables experimentales, como el diámetro y el material estructural. Además, evaluamos la efectividad de los modelos de redes neuronales y la eficacia de las representaciones de datos comparando su precisión con la de los métodos de referencia. Por lo tanto, el sistema propuesto se puede utilizar para clasificar de forma fiable y precisa varios tipos de células con diferentes propiedades físicas intrínsecas para el desarrollo de medicamentos personalizados contra el cáncer.

La separación celular de una mezcla heterogénea de células es fundamental para la investigación del cáncer y el desarrollo de nuevos fármacos personalizados1,2,3,4,5,6,7. El aislamiento preciso de distintos tipos de células proporciona una mejor comprensión de las funciones y roles celulares en los sistemas biológicos y permite la identificación de poblaciones de células específicas involucradas en la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento1,2,3,4,5,6,7,8. 9,10,11,12. Se han desarrollado técnicas de separación celular basadas en marcadores de la superficie celular, como los tintes fluorescentes13,14,3.0.co;2-l (1999)." href="/articles/s41598-022-22075-6#ref-CR15" id="ref-link-section-d9538225e490">15 y anticuerpos específicos16,17 o propiedades físicas intrínsecas de las células, incluidos el tamaño, la densidad y la compresibilidad18,19,20,21. Entre estas técnicas, los métodos de clasificación de células sin etiquetas basados ​​en Los biomarcadores físicos intrínsecos se han utilizado ampliamente porque no requieren tareas intensivas ni etiquetas específicas en la superficie celular para identificar las células de interés. Por lo tanto, los efectos secundarios no deseados sobre la fisiología y actividad celular normal se pueden minimizar en comparación con los de la clasificación celular asistida por etiquetas convencional. métodos, como la clasificación de células activadas por fluorescencia y la clasificación de células activadas magnéticamente. 18, 19. Enfoques como pinzas ópticas y plataformas de microfluidos pueden separar células de manera efectiva y confiable. Sin embargo, estos métodos adolecen de limitaciones críticas, como el efecto fototérmico junto con el uso de una fuerte intensidad de luz, técnicas difíciles y efectos indeseables de tensión de corte, fricción y bloqueo en las funciones y respuestas celulares debido a irregularidades estructurales dentro de las microestructuras20,21,22,23.

Recientemente se ha demostrado que las pinzas acústicas basadas en ultrasonido son capaces de capturar células individuales o medir las propiedades físicas de las células como un coeficiente de retrodispersión con una configuración experimental relativamente simple y rentable24,25,26,27. Se requieren pulsos de ultrasonido más largos y pulsos cortos posteriores para manipular y adquirir de forma segura señales retrodispersadas de la célula única atrapada, respectivamente, utilizando el mismo transductor o transductores diferentes para cada procedimiento. Sin embargo, la medición precisa en una sola celda atrapada es un desafío debido al uso inevitable de dos secuencias de pulsos diferentes junto con las configuraciones experimentales, lo que puede resultar en información engañosa. Para abordar esta limitación crítica, se desarrollaron pinzas acústicas con ultrasonido de alta frecuencia a una alta frecuencia de repetición de pulso (PRF) para atrapar simultáneamente una sola célula objetivo y medir sus señales retrodispersadas28. Los pulsos de ultrasonido monociclo a una PRF alta son capaces de atrapar una sola célula objetivo, con un nivel más bajo de fuerza de captura acústica en comparación con el de las pinzas acústicas convencionales con energía acústica excesiva con pulsos más largos. Además, pueden medir simultáneamente las señales retrodispersadas de los objetos atrapados del tamaño de una sola micra, para identificar dos diámetros diferentes de microperlas, como 5 y 10 \(\upmu\)m, y dos diámetros celulares diferentes, incluidos los glóbulos rojos (RBC). ) con diámetros entre 6 y 8 \(\upmu\)m y células epiteliales inmortalizadas de próstata (PNT1A) SV40 normales con diámetros entre 9 y 11 \(\upmu\)m, sin comprometer la viabilidad celular. Sin embargo, el posprocesamiento de los coeficientes de retrodispersión integrada (IB) basados ​​en señales retrodispersadas medidas suele ser un proceso que requiere mucho tiempo y causa posibles errores debido a la configuración manual del tiempo de la señal reflejada entre la primera y la pequeña señal de ultrasonido reflejada producida por el objeto único atrapado. . Además, la enorme señal de ultrasonido reflejada proviene de la delgada película de Mylar, ya que el coeficiente IB se define como la relación entre la energía retrodispersada de un volumen de dispersión y la de un objetivo de cuarzo plano. Para superar las limitaciones causadas por el análisis manual, en este estudio se emplean modelos de inteligencia artificial potenciados por el aprendizaje profundo para minimizar el posprocesamiento.

Se pueden utilizar varios enfoques para analizar las características de las células vivas, incluido el análisis manual basado en heurísticas, métodos convencionales de aprendizaje automático (ML) y modelos de aprendizaje profundo. En primer lugar, los enfoques heurísticos son simples e intuitivos, pero tienen limitaciones inherentes. Además, los algoritmos de ML convencionales no tienen capacidades suficientes para expresar correlaciones de las características de las células con los datos observados. Por último, los modelos de aprendizaje profundo de última generación (SOTA) tienen altas capacidades expresivas pero requieren una gran cantidad de datos de entrenamiento que son difíciles de recopilar a partir de células vivas. En nuestros estudios anteriores, demostramos que los modelos de redes neuronales convolucionales (CNN) relativamente poco profundos pueden ser una solución eficaz y eficiente29,30 para investigar las propiedades físicas de las células, como la rigidez celular y la estructura de la membrana celular, comparando sus imágenes microscópicas antes. y después de aplicar el haz de ultrasonido de alta frecuencia. Utilizando modelos CNN similares a VGG (Visual Geometry Group)31 como columna vertebral, las células de cáncer de mama se clasificaron con éxito en función de su invasividad y se aproximaron a los módulos de células de Young con alta precisión. Inspirándonos en nuestros estudios anteriores, nos centramos en determinar si los modelos de redes neuronales pueden identificar y separar objetos individuales del tamaño de una micra en función de patrones de señales retrodispersadas de los objetos específicos.

En este estudio, proponemos un enfoque para la clasificación automatizada de tipos de células mejorando algunos aspectos del proceso de posprocesamiento actual, junto con la detección acústica sin etiquetas de un solo objeto atrapado. Nuestros modelos CNN pueden descubrir propiedades físicas de las células analizando señales retrodispersadas. Además, esperamos que los modelos de CNN sean resistentes al ruido en señales sin procesar, como las señales reflejadas por los objetos circundantes. Para los experimentos, recopilamos señales retrodispersadas utilizando un sistema de análisis unicelular sin etiquetas28, eliminamos el ruido de las señales retrodispersadas sin procesar utilizando codificadores automáticos de CNN y clasificamos las células en sus tipos de células analizando las señales eliminadas de ruido con redes troncales de CNN y redes neuronales completamente conectadas.

Además, aunque un estudio previo28 mostró que los diámetros de las células afectan sus señales retrodispersadas, se requiere más investigación para explorar cómo otros aspectos de las células pueden conducir a diferencias en las señales retrodispersadas. Por lo tanto, intentamos revelar otras características celulares que influyen en las señales retrodispersadas y si los modelos de redes neuronales pueden capturar estas características. Las señales sin ruido se transformaron en señales de forma de onda, espectros de Fourier y espectrogramas. Posteriormente, utilizamos las redes troncales de CNN propuestas para extraer características en los dominios de tiempo, frecuencia y tiempo-frecuencia de las señales transformadas. Debido a que cada columna vertebral se centra en las características respectivas de las señales retrodispersadas, podemos asumir el tipo de propiedades de las células que causan diferencias en las características de las señales al examinar el desempeño de las columnas vertebrales en la clasificación de células y microesferas de poliestireno, según sus tipos y propiedades físicas. Por lo tanto, evaluamos el sistema propuesto con base en las siguientes preguntas de investigación:

RQ 1. Las células tienen patrones distintivos de señales retrodispersadas según su tipo;

PI 2. El análisis del espectro de frecuencias es útil para descubrir características de señales retrodispersadas;

RQ 3. Los cambios temporales en los espectros de frecuencia son significativos para analizar los patrones de señales retrodispersadas.

RQ 1 ha sido validado por el rendimiento de los modelos de redes neuronales propuestos para la clasificación automatizada de tipos de células (Tabla 1). Realizamos experimentos más detallados para examinar las características celulares que afectan las señales retrodispersadas de la siguiente manera: distinguiendo (1) tipos de células con diferentes diámetros (Tabla 1), (2) microesferas de poliestireno con diferentes diámetros (Tabla 2) y (3) microesferas. Objetos de diferentes tamaños con diferentes propiedades físicas y diámetros similares (Tabla 3). Hemos verificado RQ 2 comparando el rendimiento del análisis en el dominio del tiempo (es decir, aplicando CNN unidimensional (1D) a señales sin procesar) con el del análisis en el dominio de la frecuencia (Tablas 1, 2, 3). Además, comparamos el espectrograma con los análisis del espectro de frecuencia para validar el RQ 3 (Tablas 1, 2, 3 y Fig. 5). Además, demostramos que el ruido dificulta significativamente el rendimiento de los modelos propuestos y debe abordarse mediante pruebas de ablación (Tabla 4).

El resto de este documento está organizado de la siguiente manera. La sección "Materiales y métodos" describe el sistema de análisis unicelular sin etiquetas utilizado para recopilar señales retrodispersadas de células vivas, el modelo de codificador automático propuesto para eliminar el ruido de señales retrodispersadas sin procesar y las redes troncales de CNN propuestas para descubrir propiedades celulares a partir de señales retrodispersadas. En la sección "Resultados", presentamos procedimientos y resultados experimentales para evaluar el sistema de clasificación propuesto y validar nuestras preguntas de investigación. La discusión, las observaciones finales y las direcciones de investigación futuras se presentan en la sección "Discusión y observaciones finales".

Se recogieron señales retrodispersadas de dos tipos de células (PNT1A y RBC) y microesferas de poliestireno (5 \(\upmu\)m y 10 \(\upmu\)m) utilizando un sistema de análisis unicelular sin etiquetas28. Aplicamos el codificador automático de eliminación de ruido y clasificadores basados ​​en redes neuronales artificiales para validar nuestra suposición, es decir, la señal retrodispersada es significativamente distintiva al distinguir tipos particulares de células de los demás. El modelo de codificador automático propuesto eliminó el ruido de las señales retrodispersadas y nuestros clasificadores CNN fueron entrenados para descubrir propiedades de las células a partir del análisis en el dominio del tiempo o en el dominio de la frecuencia.

La Figura 1a muestra una configuración experimental para el aislamiento y análisis de una sola célula sin etiquetas, compuesta por un transductor de ultrasonido de alta frecuencia altamente enfocado hecho a medida y operado con su red de adaptación de impedancia junto con un sistema frontal personalizado, un sistema tridimensional (3D). ) platina lineal, un osciloscopio y un microscopio de fluorescencia invertida con una herramienta de adquisición y análisis de imágenes28. El transductor de alta frecuencia altamente enfocado basado en niobato de litio (\(LiNbO_3\)) con un tamaño de apertura de 2,6 mm y un número de enfoque de 0,75 fue diseñado y fabricado de acuerdo con el proceso de fabricación del transductor32. La red de adaptación de impedancia conectable se desarrolló para maximizar la eficiencia de la transferencia de energía entre el transductor y el sistema frontal personalizado33. La ubicación del transductor de alta frecuencia hecho a medida con la red de adaptación de impedancia se ajustó con precisión mediante una etapa lineal 3D (SGSP 20, Sigma KOKI Co., Japón) controlada por un programa personalizado de LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, EE. UU.) . Un sistema frontal personalizado desarrollado en una placa de circuito impreso (PCB) compacta y rentable estaba compuesto por un transmisor para generar alta frecuencia (\(\ge 100\) MHz) y alto PRF (\(\ le 1\) MHz) pulsos bipolares monociclo, un receptor con una relación señal-ruido mejorada para amplificar señales de retrodispersión considerablemente débiles, y un expansor y limitador basado en diodos para proteger el transmisor y el receptor, respectivamente28, 100 MHz) aplicaciones de ultrasonido. en Actas del Simposio Internacional de Ultrasonidos IEEE 2013 (IUS 2013), 1567–1570. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2013.0399 (IEEE, Praga, República Checa, 2013)." href="#ref-CR34" id="ref-link-section-d9538225e3910">34,35,36 Las señales retrodispersadas del objeto individual atrapado en la película Mylar acústicamente transparente se registraron con una frecuencia de muestreo de 10 GHz utilizando el osciloscopio (104MXi, LeCroy, Santa Clara, CA, EE. UU.) y el microscopio de fluorescencia invertida (IX71, Olympus, Center Valley). , PA, EE. UU.) con la herramienta de adquisición y análisis de imágenes (Metamorph, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) se utilizaron para adquirir imágenes de campo brillante con resolución temporal para demostrar el atrapamiento inducido por pulsos de ultrasonido de alta frecuencia y el movimiento de un solo objeto, como como partícula o célula.

Sistema de análisis y separación unicelular sin etiquetas. (a) Configuración experimental que consta de un transductor de ultrasonido de alta frecuencia con una red de adaptación de impedancia, un sistema frontal personalizado, una etapa lineal tridimensional, un osciloscopio y un microscopio de fluorescencia invertido con una herramienta de adquisición y análisis de imágenes. (b) Forma de onda del pulso medida y su espectro del sistema frontal personalizado. (c) Forma de onda de pulso-eco medida y su espectro de transductor de ultrasonido de alta frecuencia con red de adaptación de impedancia. ( d – f ) Presiones de ultrasonido espacial medidas del transductor de ultrasonido de alta frecuencia con red de adaptación de impedancia.

La Figura 1b representa el rendimiento medido del sistema frontal capaz de generar pulsos bipolares monociclo con una frecuencia central de 200 MHz y un ancho de banda de \(-6\) dB de 110–290 MHz. El rendimiento del transductor de ultrasonido de alta frecuencia desarrollado con su red de adaptación de impedancia se midió mediante una respuesta de pulso-eco con un cuarzo plano y una imagen fantasma de alambre con un alambre de tungsteno de 2,5 \(\upmu\)m de diámetro en agua desgasificada y desionizada. . A partir de la respuesta pulso-eco en la Fig. 1c, la frecuencia central medida y el ancho de banda de \(-6\) dB del transductor de ultrasonido de alta frecuencia con la red de adaptación de impedancia fueron 153 MHz y 144–162 MHz, respectivamente. Las dimensiones axiales y laterales medidas del foco del transductor fueron 28,5 y 8,6 \(\upmu\)m, respectivamente, definidas por el ancho total a la mitad del máximo (FWHM, \(-6\) dB presión) del campo de presión basado en la imagen del objetivo de cable como se presenta en las figuras 1d – f.

Además, en la Fig. 2 se demostró la capacidad de los pulsos de ultrasonido monociclo a alta PRF para atrapar un solo objeto objetivo. El sistema de calibración de la fuerza de captura acústica se desarrolló con un controlador de presión (ez-gSEAL 100B, Neobiosystem, CA, EE. UU.), un vidrio capilar con filamento (GD-1, Narishige, NY, EE. UU.) y un extractor de micropipetas vertical (PC-10, Narishige, NY)37,38,39. Fuerza de captura acústica medida de \(122,4 \pm 13,4\) nN (\(n = 3\)) generada por pulsos eléctricos monociclo con una longitud de pulso de 6,7 ns y voltaje de entrada aplicado de 50 V a una PRF de 167 kHz habilitado para simultáneamente capture y mueva microesferas, glóbulos rojos y células PNT1A junto con la dirección del transductor, y adquiera señales retrodispersadas del objeto único atrapado.

Atrapamiento acústico de (a – c) la microesfera de poliestireno única objetivo, (d – f) RBC y (g – i) célula PNT1A con movimiento del transductor de ultrasonido de alta frecuencia. Los círculos discontinuos amarillos y rojos indican las ubicaciones inicial y movida del transductor, respectivamente. Las barras de escala en las imágenes indican (a–c) 100 \(\upmu\)m y (d–i) 20 \(\upmu\)m.

Se obtuvieron muestras de sangre humana fresca de voluntarios sanos que proporcionaron el formulario de consentimiento informado. Todos los experimentos con la sangre obtenida se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas por la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad del Sur de California (UP-16-00713). La sangre completa recolectada se centrifugó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) a 500 g durante 10 minutos para separar los glóbulos rojos. Después de eliminar suavemente el sobrenadante, los glóbulos rojos en PBS se centrifugaron nuevamente y se resuspendieron en una solución mixta de PBS y solución de Alsever. Se cultivaron células PNT1A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10\(\%\) como una monocapa en una incubadora a 37 \(\circ\)C con humidificador. atmósfera de 5\(\%\) CO\(_2\). Las células PNT1A se lavaron suavemente dos veces con PBS, se dispensaron con solución TrypLE en una incubadora durante 5 minutos y se centrifugaron a 150 g durante 5 minutos para separarlas. Después de eliminar suavemente el sobrenadante, las células PNT1A en PBS se centrifugaron nuevamente y se resuspendieron en PBS de Dulbecco con Ca\(^{2+}\) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

Como era difícil capturar con precisión las señales retrodispersadas de las células dentro de las señales de los objetos circundantes, como la película de mylar, inicialmente llevamos a cabo el proceso de recuperar señales retrodispersadas de las células enterradas bajo los reflejos de otros objetos circundantes. Recientemente, se han empleado ampliamente modelos de codificadores automáticos con eliminación de ruido para resolver este problema40,41. Un codificador automático, que es una arquitectura de red neuronal artificial, comprime características extraídas de los datos de entrada en vectores de características de baja dimensión (o matrices/tensores) y recupera la entrada original de los vectores de características. Debido a la dimensionalidad de los vectores de características, el codificador automático no puede recuperar todos los detalles de la entrada y solo quedan características distintivas en su salida.

Los modelos de redes neuronales recurrentes (RNN), que consideran la \(n+1\)-ésima entrada y la n-ésima salida para generar la \(n+1\)-ésima salida, se han utilizado ampliamente para analizar datos secuenciales. Aunque el mecanismo RNN es eficaz para aprender correlaciones temporales entre muestras de entrada, también provoca una limitación inherente denominada problema de dependencia a largo plazo42. Debido a este problema, los insumos anteriores tienen menos preferencia que los posteriores y finalmente se olvidan. Debido a que las características de las células no se reflejan en las últimas muestras de señales retrodispersadas, se requieren modelos que puedan analizar todas las muestras juntas. Por lo tanto, utilizamos un codificador automático convolucional 1D para eliminar el ruido. Para cada muestra de las señales, las operaciones de convolución 1D acumulan información sobre las muestras temporalmente adyacentes. Aunque cada filtro de convolución se centra en el contexto local, podemos extraer las características globales de las señales apilando las capas de convolución. Por lo tanto, el codificador automático convolucional 1D puede superar las limitaciones del codificador automático recurrente y es más adecuado para datos secuenciales que los modelos de codificador automático convolucional 2D o completamente conectado. Además, empleamos convolución dilatada para descubrir de manera eficiente características globales a partir de las señales.

Las capas de convolución dilatadas extienden los campos receptivos de operaciones convencionales que observan solo muestras o píxeles adyacentes. Por lo tanto, cuando dos muestras que están temporalmente distantes tienen correlaciones, necesitamos numerosas capas para propagar información de una muestra a la otra. La convolución dilatada puede resolver este problema ampliando los campos receptivos de las operaciones de convolución. La observación de rangos más amplios a la vez nos permitió analizar las correlaciones entre muestras distantes y al mismo tiempo reducir el número de capas. Samal et al.43 propusieron un modelo de codificador automático convolucional 1D que reemplaza las capas de muestreo ascendente/descendente con capas convolucionales. Este enfoque hace que los campos receptivos sean más amplios pero computacionalmente costosos. Nuestros resultados experimentales en la Tabla 4 muestran que el número actual de parámetros es suficiente para aprender las características de las señales retrodispersadas de las células.

Como se muestra en la Fig. 3a, la parte del codificador del modelo de codificador automático propuesto consta de seis capas de convolución 1D dilatadas, tres capas de agrupación máxima y dos capas completamente conectadas. A partir de los vectores de características de compresión Z generados por el codificador, el decodificador restaura las señales originales utilizando siete capas de convolución 1D dilatadas y tres capas de muestreo ascendente. Esto se puede formular de la siguiente manera:

donde X es la señal sin procesar adquirida de las celdas, \(\hat{X}\) es la señal sin ruido restaurada a partir de los vectores de características, y \(W_e\) y \(W_d\) denotan los conjuntos de parámetros del codificador y decodificador, respectivamente. \(f(\cdot ;\cdot )\) y \(g(\cdot ;\cdot )\) representan el codificador y el decodificador, respectivamente. La función de activación de las capas en el codificador automático propuesto fue la unidad lineal rectificada (ReLU), y se emplearon la pérdida de error absoluto medio (MAE) y el optimizador Adam44 para entrenar el codificador automático. Las Figuras 4a a d muestran que el codificador automático propuesto recupera características de alta frecuencia en las señales sin procesar. Sin embargo, emplear únicamente un codificador automático con eliminación de ruido no contribuye significativamente a la precisión de la clasificación celular, como se muestra en la Tabla 4.

Estructuras de los modelos CNN propuestos. El sistema propuesto consta de tres componentes principales: el transductor de ultrasonido de alta frecuencia en la Fig. 1, el codificador automático de eliminación de ruido en (a) y los clasificadores CNN en (b) y (c). El codificador automático de eliminación de ruido reduce el ruido y enfatiza las características latentes en las señales retrodispersadas recopiladas por los transductores de ultrasonido de alta frecuencia. Las señales sin ruido fueron procesadas por FFT o STFT. En el análisis de la forma de onda, no realizamos procesamiento adicional de las señales sin ruido. Luego, las señales (o espectros/espectrogramas) se convierten en entradas a los modelos CNN para clasificar las células según el tipo de célula.

Resultados de los modelos de autocodificadores de eliminación de ruido propuestos. Las figuras del lado izquierdo son espectrogramas de una célula PNT1A y los espectrogramas de un RBC están en el lado derecho. Los ejes X e Y indican el tiempo y la frecuencia, respectivamente. Además, el brillo de los colores se refiere a la intensidad de los componentes de frecuencia. La unidad de tiempo corresponde a 16 muestras en la señal, y las unidades de frecuencia e intensidad son Hz y dB, respectivamente. (a) y (b) son los espectrogramas extraídos de la señal original, (c) y (d) se basan en nuestro codificador automático de eliminación de ruido que utiliza CNN 1D, y (e) y (f) son casos en los que el codificador automático de eliminación de ruido y el sistema gaussiano La inyección de ruido se utilizó conjuntamente.

La inyección de ruido gaussiano puede mejorar la robustez del sistema propuesto frente al ruido y el entorno en la etapa de reducción y clasificación del ruido45. Como se muestra en la Fig. 3a, la señal original X se corrompe a una señal ruidosa \(\tilde{X}\) mediante un mapeo estocástico \(\tilde{X} \sim q(\tilde{X} \mid X) \) con ruido gaussiano \(n \sim N(0, \sigma _n^2)\). La señal corrupta se utilizó como datos de entrada al codificador para extraer la característica Z y obtener el resultado de eliminación de ruido reconstruido \(\hat{X}\), de la siguiente manera:

Además, debido a que el ruido se genera aleatoriamente, podemos ampliar el número de señales de entrada. A través de este proceso de aumento de datos, se puede entrenar el codificador automático para distinguir los patrones distintivos de las señales retrodispersadas del ruido redundante. Aplicamos este método de aumento a la eliminación de ruido y a los clasificadores. La Figura 4 muestra ejemplos de señales sin procesar recopiladas de células RBC y PNT1A, los resultados del codificador automático propuesto y casos en los que se inyecta ruido gaussiano en las entradas del codificador automático.

Este estudio no empleó arquitecturas sofisticadas de redes neuronales para clasificar las señales retrodispersadas de las células en tipos de células. A pesar del alto rendimiento de los modelos de aprendizaje profundo SOTA, resulta complicado recopilar los datos a gran escala necesarios para entrenar estos modelos a partir de células vivas. Como se demostró en nuestros estudios anteriores29,30, los modelos de redes neuronales relativamente poco profundos pueden ser una solución eficiente y eficaz para analizar células vivas con una cantidad limitada de datos. Las estructuras de nuestros modelos CNN son similares a las de VGG1631 pero emplean técnicas para ampliar los campos receptivos y evitar el sobreajuste. Los patrones de señales retrodispersadas de las células no eran tan claramente visibles a simple vista tanto en las señales del dominio del tiempo como de la frecuencia (Fig. 4). Sin embargo, los modelos CNN propuestos recuperaron efectivamente patrones que estaban enterrados bajo el ruido.

En VGG1631, fijar el tamaño del núcleo convolucional en \(3\times 3\) y aumentar la profundidad de la red mejora la precisión de la clasificación. Realizar múltiples convoluciones con un filtro pequeño reduce la cantidad de parámetros en comparación con emplear algunas capas de convolución con filtros grandes. Este enfoque nos permitió aumentar la eficiencia del entrenamiento y reducir el riesgo de sobreajuste. Al mismo tiempo, a medida que aumentaba el número de capas, el modelo CNN podía extraer características no lineales de áreas más amplias de los datos de entrada.

Sin embargo, extraer características de muestras adyacentes en las señales retrodispersadas provoca dificultades a la hora de capturar las características globales de las señales. Para abordar este problema, Lu et al.46 mejoraron el rendimiento de la clasificación de gliomas utilizando ResNet47 con convolución dilatada48, que puede obtener un campo receptivo más grande sin aumentar el tamaño de los núcleos de convolución. Chen et al.49 propusieron un método de segmentación pulmonar que combina U-Net50 y convolución dilatada en imágenes de tomografía computarizada (TC). Aplicamos modelos similares a VGG fusionados con convolución dilatada a las señales retrodispersadas de las células para extender los campos receptivos de los filtros de convolución. Por lo tanto, obtuvimos características de señal que consideraron tanto la perspectiva local como la global con solo una pequeña cantidad de capas y parámetros de convolución.

Además, la distribución de entrada de cada capa cambió porque los parámetros de las capas anteriores se actualizaron en función de las épocas. Por lo tanto, a medida que los modelos de redes neuronales se profundizaron, la distribución de entrada fluctuó significativamente, lo que hizo que el aprendizaje de parámetros fuera inestable. Por lo tanto, aplicamos la normalización por lotes51 a cada capa, lo que normaliza la salida de las capas para mejorar la velocidad y la eficiencia del aprendizaje. Además, empleamos regularización e inicialización de pesos, sesgos y capas de abandono para aumentar la eficiencia del entrenamiento y evitar el sobreajuste. La arquitectura detallada de los modelos de redes neuronales propuestos se presenta en el resto de esta sección.

Aplicamos el mismo clasificador CNN 1D para analizar las formas de onda y los espectros de frecuencia de las señales retrodispersadas sin ruido de las células. El clasificador CNN 1D constaba de siete capas de convolución 1D dilatadas, tres capas completamente conectadas, siete capas de abandono y cuatro capas de agrupación máxima, como se muestra en la figura 3b. Además, llevamos a cabo una normalización por lotes para cada capa de convolución, y se aplicaron regularización L2 e inicialización normal de Xavier52 tanto a los pesos como a los sesgos de la convolución y las capas completamente conectadas.

Los estudios existentes28 sobre métodos para recopilar señales retrodispersadas de las células supusieron que los tamaños de las células/partículas afectan los espectros de frecuencia de las señales retrodispersadas. Además, como se describe en la sección anterior, un sistema de análisis unicelular sin etiquetas aplica microhaces de ultrasonido de alta frecuencia a las células durante un tiempo significativamente corto. Por lo tanto, la señal retrodispersada desde las células también es significativamente corta en comparación con la señal completa, como se muestra en la Fig. 4. Si analizamos la forma de onda directamente, la búsqueda de un período corto, incluidas señales sustanciales de las células, puede ser una carga adicional. Sin embargo, en el análisis del espectro de frecuencias sí consideramos este punto. Por lo tanto, esperábamos realizar el análisis del espectro de frecuencia con una precisión mayor y más estable que el análisis de forma de onda.

Utilizando la transformada rápida de Fourier (FFT)53, extrajimos los espectros de frecuencia de las señales retrodispersadas, que fueron eliminadas por el modelo de codificador automático propuesto. Para una señal discreta \(\hat{X}(n)\) donde \(n \in [0, N-1]\), y N es el número de muestras, su espectro de frecuencia \(\hat{X} (f)\) y FFT se pueden formular como:

donde \(i=\sqrt{-1}\) es una unidad imaginaria y \(f \in [0, N-1]\) corresponde a los componentes de frecuencia. Por lo tanto, \(\hat{X}(f)\) indica la amplitud de la frecuencia f en \(\hat{X}(n)\). Como \(\hat{X}(f)\) es una función simétrica, solo usamos su mitad derecha.

Tanto las señales de frecuencia como las de forma de onda eran datos secuenciales. Sin embargo, pudimos controlar la longitud total de las señales, que es mucho más larga que las señales reales retrodispersadas de las células, y las muestras posteriores o los componentes de mayor frecuencia no fueron más significativos que las muestras anteriores o los componentes de menor frecuencia. Por lo tanto, extrajimos características locales de señales en los dominios de tiempo y frecuencia utilizando una CNN 1D en lugar de una RNN, lo que puede provocar la volatilización de entradas anteriores. Luego se entrenaron las capas completamente conectadas para descubrir diferencias en las características locales según los tipos de células. La Figura 3b muestra la estructura detallada del clasificador CNN 1D propuesto. En este estudio, evaluamos el sistema propuesto distinguiendo las células cancerosas en la sangre (PNT1A) de los glóbulos rojos. Por lo tanto, utilizamos activación sigmoidea en la capa de salida y pérdida de entropía cruzada binaria. Para aumentar aún más la robustez del sistema al ruido y evitar el sobreajuste, realizamos un aumento de datos utilizando ruidos gaussianos, como con el codificador automático propuesto. Para el análisis del espectro de frecuencia, primero inyectamos ruido gaussiano y luego realizamos una FFT. Tanto para los espectros de frecuencia como para las señales de forma de onda, el clasificador CNN 1D se puede formular como:

donde \(Y_i\) y \(\hat{Y_i}\) son los tipos de celda reales y predichos, respectivamente, que corresponden a la i-ésima señal de entrada \(X_i\), \(h_{1D}(\cdot ;\cdot )\) representa el modelo CNN 1D propuesto, y \(W_c\) denota un conjunto de parámetros del modelo.

Las amplitudes de los componentes de frecuencia y los cambios temporales en las amplitudes se revelaron en los espectros de frecuencia y las señales de forma de onda, respectivamente. La transformación en el dominio del tiempo-frecuencia se puede emplear para analizar las características de la frecuencia y la amplitud simultáneamente. Esperamos que esta integración, llamada espectrograma, pueda describir varias características de las células mejor que las representaciones 1D. El espectrograma representa la intensidad de las señales en el plano tiempo-frecuencia (espacio 2D), como se muestra en la Fig. 4. Para la transformación, empleamos una transformada de Fourier de corto plazo (STFT)54 que conduce consecutivamente FFT durante parte de un señal mediante una ventana corredera de longitud fija. Cuando el tamaño de la ventana era l y el tamaño del paso era d, primero realizamos FFT para una señal \(\langle \hat{X}(0), \ldots , \hat{X}(l-1) \rangle\) , y en la siguiente iteración la ventana se movió a \(\langle \hat{X}(d), \ldots , \hat{X}(d+l-1) \rangle\) (en este estudio, \(l =32\) y \(d=16\)). En consecuencia, obtuvimos los espectros de frecuencia para cada ventana de tiempo. Esto se puede formular de la siguiente manera:

donde w(n) es la función de ventana y m es la variable de frecuencia discreta. La señal sin procesar se dividió en nueve segmentos con una superposición del \(50\%\); cada segmento tenía una ventana de Hamming y la frecuencia de muestreo era de 1.000.000 Hz. El espectrograma es la magnitud al cuadrado de STFT.

Zhu et al.55 aplicaron una CNN 1D al análisis del dominio de frecuencia de espectrogramas y memoria a corto plazo (LSTM) para analizar cambios temporales en los espectros de frecuencia. Este enfoque de convolución RNN tiene ventajas al representar las características temporales de los datos de manera explícita. Sin embargo, las capas recurrentes provocan problemas de dependencia a largo plazo. Por lo tanto, en este estudio, aplicamos convolución 2D dilatada a los espectrogramas para capturar la estructura local característica en la que el tipo de célula se distingue de la señal completa.

Debido a que analizamos el mismo problema de clasificar tipos de células en el dominio de tiempo-frecuencia, se construyó un modelo CNN 2D ampliando el número de dimensiones en la estructura del modelo CNN 1D presentado en la sección anterior. La principal diferencia entre el clasificador CNN 2D y el CNN 1D es la cantidad de parámetros resultantes del mayor número de dimensiones, mientras que sus estructuras son casi idénticas.

La Figura 3c muestra en detalle la arquitectura del clasificador CNN 2D propuesto. Para la clasificación binaria de tipos de células, la función de activación en la capa de salida y la función de pérdida son la activación sigmoidea y la pérdida de entropía cruzada binaria, respectivamente. Antes de aplicar el SFTF a señales sin procesar, realizamos un aumento de datos utilizando ruidos gaussianos para abordar la robustez del clasificador ante el ruido y el sobreajuste, como con el clasificador 1D CNN. Por lo tanto, el clasificador CNN 2D para el espectrograma de señales se puede formular de manera similar a la ecuación. (4).

Validamos nuestras preguntas de investigación aplicando el sistema propuesto para clasificar células vivas (RBC y PNT1A). Como combinación del equipo de ultrasonido existente (es decir, un sistema de análisis unicelular sin etiquetas) y los modelos CNN convencionales, la importancia del sistema propuesto proviene de la automatización de la clasificación de tipos de células mediante el análisis de las señales retrodispersadas de las células. Por lo tanto, primero validamos la distinción de las señales retrodispersadas (RQ 1) examinando si el sistema propuesto es capaz de distinguir células vivas de otras células o partículas (Tablas 1, 2, 3). En el análisis de señales, presentamos tres enfoques (forma de onda, espectro de frecuencia y análisis de espectrograma) basados ​​en el preprocesamiento de las señales. Estos enfoques tienen ventajas y desventajas en términos de la complejidad computacional del preprocesamiento y el entrenamiento de modelos. Por lo tanto, intentamos verificar si el preprocesamiento adicional contribuyó al rendimiento de todo el sistema (RQ 2 y RQ 3). Esta verificación también reveló la importancia de las características del dominio de frecuencia y tiempo de las señales retrodispersadas desde las células (Fig. 5). Además, como se muestra en la Fig. 4, las señales recopiladas eran ruidosas y nuestro período de interés era un pulso significativamente corto. Por lo tanto, evaluamos la robustez del sistema propuesto al ruido y la contribución del codificador automático propuesto al rendimiento del sistema mediante la realización de pruebas de ablación para técnicas de eliminación de ruido (Tabla 4).

Evaluación del rendimiento del modelo propuesto en términos de exactitud (A), precisión (P), recuperación (R) y medida \(F_1\) (\(F_1\)) en función de la resolución de frecuencia. Las líneas sólidas y punteadas indican los resultados del entrenamiento de la señal en el espectro de frecuencia (Freq) y el espectrograma (Freq+Temp), respectivamente.

Esta sección describe la configuración experimental, incluidos los conjuntos de datos, las métricas de evaluación, la configuración de hiperparámetros y los métodos de referencia. Recopilamos 77 señales para cada tipo de célula (12 células RBC y 12 PNT1A) y 146 señales para microesferas de poliestireno (72 señales obtenidas de 17 microesferas de 5 \(\upmu\)m y 74 señales medidas de 14 microesferas de 10 \(\ upmu\)m). La media y la desviación estándar del tamaño de las células RBC y PNT1A fueron \(6.57 \pm 0.66\;\upmu\)m y \(10.10 \pm 0.88\;\upmu\)m, respectivamente, y las de 5 \( Las microesferas \upmu\)m y 10 \(\upmu\)m eran \(4.98 \pm 0.06\;\upmu\)m y \(9.97 \pm 0.07\;\upmu\)m, respectivamente. Las señales retrodispersadas de un solo objeto, como una microesfera o una célula, se midieron mediante ultrasonidos en estado atrapado acústicamente. Debido a que fueron atrapados y medidos simultáneamente, la señal se pudo obtener únicamente del objeto objetivo en lugar de información de los objetos circundantes, lo que podría ser la principal ventaja de esta tecnología. Sin embargo, estos complejos procedimientos experimentales también causan dificultades a la hora de obtener grandes conjuntos de datos. Un conjunto de datos pequeño es una limitación intrínseca del dominio del análisis unicelular utilizando pinzas acústicas56,57,58,59,60,61,62, lo que puede generar problemas de sobreajuste y confiabilidad de los datos de los resultados experimentales. Para abordar posibles problemas, inicialmente realizamos una validación cruzada triple para examinar si el modelo propuesto podría abordar la diversidad de células vivas. En cada experimento, dividimos nuestro conjunto de datos en tres partes iguales, preservando al mismo tiempo las distribuciones de etiquetas (p. ej., tipos de células y microesferas). Para garantizar que cada señal retrodispersada se utilizara como muestra de prueba al menos una vez, cada caso de validación empleó dos de las tres partes del conjunto de datos como datos de entrenamiento y la parte restante como datos de prueba. Posteriormente, aumentamos el conjunto de datos inyectando ruido aleatorio gaussiano. Generamos diez señales ruidosas para cada señal retrodispersada original en los datos de entrenamiento.

Utilizamos cuatro métricas de evaluación: precisión (A), precisión (P), recuperación (R) y \(F_1\) medida (\(F_1\)). Cuando T indica un conjunto de células PNT1A detectadas automáticamente y \(T^*\) se refiere a un conjunto de células PNT1A reales, la precisión se puede formular como:

donde U denota el conjunto universal de celdas de nuestro conjunto de datos y \(|\cdot |\) denota el número de elementos del conjunto.

El modelo y los clasificadores del codificador automático de eliminación de ruido se implementaron utilizando Keras en Python. Realizamos una búsqueda en cuadrícula de los hiperparámetros del codificador automático de eliminación de ruido propuesto; el número de épocas (\(\varepsilon\)): 100–300 con un tamaño de paso de \(+50\), tasa de aprendizaje (\(\rho\)): 0,0001–0,1 con un tamaño de paso de \(\ veces 10\), tamaño de lote: 3–18 con un tamaño de paso de \(+3\), tamaño del vector de características (Z): 625–2500 con un tamaño de paso de \(\times 2\) y factor de ruido ( \(\sigma _n\)): 0,1–0,5 con un tamaño de paso de \(+0,1\). El modelo propuesto tuvo el mejor rendimiento en: \(\varepsilon\) de 200, \(\rho\) de 0,01, tamaño de lote de 12, tamaño del vector de características (Z) de 1250 y \(\sigma _n\) de 0,1 . También buscamos hiperparámetros del STFT; el tamaño de la ventana (w): 8–64 con un tamaño de paso de \(\times 2\), y el tamaño de superposición: 2–16 con un tamaño de paso de \(\times 2\). Con base en una búsqueda de cuadrícula, determinamos el tamaño de la ventana como 32 y el tamaño de superposición como 16. Para los clasificadores, aplicamos la capa de agrupación máxima con un tamaño de agrupación de 2 y (2, 2) en la CNN 1D y 2D, respectivamente. , y las tasas de deserción se fijaron en 0,2. Los hiperparámetros de los clasificadores propuestos se seleccionaron de la siguiente manera; \(\varepsilon\): 30–250 con un tamaño de paso de \(+20\), \(\rho\): 0,0001–0,1 con un tamaño de paso de \(\times 10\) y tamaño de lote: 3 –18 con un tamaño de paso de \(+3\). El modelo CNN tuvo el mejor rendimiento en: \(\rho\) de 0,001, tamaño de lote de 15 y \(\varepsilon\) de 50 para los clasificadores CNN 1D y 2D.

Además, para demostrar la necesidad de modelos de redes neuronales, comparamos el rendimiento de los clasificadores propuestos con el de los algoritmos de ML convencionales, incluida la máquina de vectores de soporte (SVM), la regresión logística (logit) y los perceptrones multicapa (MLP). Buscamos el núcleo óptimo de SVM entre los núcleos de función de base lineal, polinómica y radial (RBF), y el clasificador SVM tuvo el mejor rendimiento con el núcleo lineal. Compusimos el clasificador MLP con cinco capas ocultas con 100 unidades ocultas y las funciones de activación ReLU. La activación sigmoidea se utilizó en la capa de salida de este modelo, y su función de pérdida fue la pérdida binaria de entropía cruzada. Los parámetros del modelo MLP se inicializaron y actualizaron utilizando la inicialización normal de Xaiver52 y el optimizador Adam44, respectivamente, al igual que con los clasificadores propuestos. Realizamos la búsqueda de hiperparámetros para el modelo MLP de la misma manera que los clasificadores de CNN. El clasificador MLP obtuvo el mejor rendimiento con: \(\rho\) de 0,001, tamaño de lote de 12 y \(\varepsilon\) de 100.

Investigamos si el sistema propuesto puede distinguir de manera adecuada y efectiva las células de otros objetos del tamaño de una micra basándose en los siguientes experimentos: (1) clasificar tipos de células con diferentes diámetros (p. ej., células RBC y PNT1A), (2) distinguir microesferas de poliestireno con diferentes diámetros (por ejemplo, 5 \(\upmu\)m y 10 \(\upmu\)m), y (3) clasificar objetos del tamaño de una micra con diferentes propiedades físicas y diámetros similares (por ejemplo, 5 \(\upmu\)m microesferas con glóbulos rojos y microesferas de 10 \(\upmu\)m con células PNT1A). Los resultados experimentales revelaron las características de las células que se reflejaban en los patrones de sus señales retrodispersadas.

Validamos RQ 1 por la singularidad de las señales retrodispersadas de las células en función de la efectividad de los modelos propuestos. Intentamos distinguir las células PNT1A de los RBC utilizando los clasificadores CNN propuestos. Si las señales retrodispersadas reflejan propiedades importantes de las células, como el tamaño y el material estructural, los clasificadores serán muy precisos y viceversa. La Tabla 1 enumera los resultados experimentales.

Como se describe en la parte superior de la Tabla 1, el análisis del dominio de tiempo-frecuencia exhibió el mejor desempeño entre los tres clasificadores en términos tanto de precisión promedio como de varianza. Tanto el análisis en el dominio de la frecuencia como en el dominio del tiempo-frecuencia mostraron una precisión perfecta en el segundo y tercer pliegue. Por el contrario, el dominio de la frecuencia tuvo una precisión ligeramente menor que los otros dominios en el primer pliegue. En comparación con los otros dos clasificadores, el clasificador propuesto para señales de forma de onda tenía una precisión ligeramente menor pero similar en el primer y segundo pliegue. Sin embargo, el análisis en el dominio del tiempo mostró un rendimiento bajo en el tercer pliegue, incluso más bajo que el de los métodos de ML convencionales. Supusimos que los datos de prueba del tercer pliegue pueden incluir señales que solo se distinguen mediante características del dominio de la frecuencia. Además, las características del dominio de la frecuencia fueron más robustas ante muestras inusuales que la forma de onda. No obstante, en promedio, los clasificadores propuestos lograron una alta precisión de clasificación (\(\ge 0,88\)), independientemente de las representaciones de datos y las métricas de precisión. Por lo tanto, los resultados experimentales indican que los patrones de señales retrodispersadas pueden ser una característica eficaz para distinguir tipos particulares de células (RQ 1).

Además, validamos la necesidad de modelos potenciados por el aprendizaje profundo comparando los clasificadores propuestos con los métodos de ML convencionales, como se presenta en la parte inferior de la Tabla 1. Aplicamos los mismos métodos de preprocesamiento, incluida la eliminación de ruido y el aumento, con los clasificadores propuestos a la grupo de comparación para una comparación justa. Los clasificadores propuestos superaron a los métodos de referencia y su mejora en el rendimiento fue más vívida en los análisis de dominio de tiempo y frecuencia que en el dominio de tiempo-frecuencia. Supusimos que la combinación de las características del dominio del tiempo y la frecuencia puede proporcionar información más abundante para las células en los clasificadores. Sin embargo, la clara mejora indica que las propiedades de las células en las señales retrodispersadas son difíciles de revelar utilizando métodos convencionales y se requieren las capacidades de análisis de los modelos CNN. Durante la búsqueda de hiperparámetros, SVM con el núcleo lineal tuvo una precisión ligeramente mayor (\(\le 0.02\) en términos de medida \(F_1\)) que con los otros núcleos no lineales. Este punto puede verse en contraposición a que los clasificadores CNN propuestos, que son modelos no lineales, superaron significativamente a SVM con el núcleo lineal. Sin embargo, considerando la pequeña brecha de rendimiento entre los núcleos SVM y las diferencias en sus arquitecturas de modelos, la mayor complejidad del modelo de los clasificadores CNN podría hacerlos más capaces de expresar correlaciones complicadas de características de señal con características de celda que SVM. Podemos encontrar un resultado similar en el sentido de que SVM no superó ni superó consistentemente tanto a la regresión logística como a MLP, que son no lineales. Por lo tanto, asumimos que la (no) linealidad de los modelos influyó menos en su efectividad en el análisis de señales retrodispersadas que sus arquitecturas. MLP superó a otros métodos de referencia, como SVM y regresión logística, para espectros de frecuencia y forma de onda. Sin embargo, MLP tuvo un rendimiento significativamente inferior en los espectrogramas, lo que demuestra que MLP puede no ser adecuado para analizar características secuenciales, como cambios dinámicos en los espectros de frecuencia.

A continuación, el modelo propuesto se utilizó para clasificar dos microesferas de poliestireno de diferentes tamaños (diámetros de 5 y 10 \(\upmu\)m) para centrarse en el efecto de la diferencia de tamaño al excluir la posibilidad de diferencias de materiales estructurales.

Un experimento anterior demostró que el sistema propuesto podía distinguir células con diferentes propiedades físicas, incluido el tamaño y el material estructural. A continuación, nos centramos en el efecto de las diferencias de tamaño excluyendo la posibilidad de diferencias de materiales estructurales. Aplicamos el sistema propuesto a microesferas de poliestireno de diferentes tamaños y del mismo material estructural. El sistema clasificó dos tipos de microesferas de poliestireno según sus tamaños (5 y 10 \(\upmu\)m) analizando sus patrones de señal retrodispersada. La Tabla 2 presenta la precisión de clasificación de los modelos propuestos para microesferas de poliestireno.

Los modelos propuestos mostraron alta precisión y baja variación para clasificar microesferas de poliestireno de diferentes tamaños. Este resultado es consistente con nuestro estudio anterior28 y respalda que los diámetros de los objetos del tamaño de una micra afectan los patrones de las señales retrodispersadas. Sin embargo, los resultados de las microesferas de poliestireno también fueron diferentes de los resultados experimentales de las células. En la clasificación celular, el análisis del espectro de frecuencia superó al análisis de la forma de onda y los cambios temporales en los espectros de frecuencia contribuyeron a la precisión de la clasificación. Sin embargo, los análisis de formas de onda y espectro de frecuencia superaron al análisis de espectrograma en la clasificación de microesferas. Este resultado indica que las señales de forma de onda y los espectros de frecuencia incluyen características suficientes para determinar las diferencias de tamaño en objetos del tamaño de una micra. Además, podemos suponer que las características de los cambios temporales en los espectros de frecuencia son excesivamente abundantes para la clasificación de tamaño. Básicamente, los patrones de señales retrodispersadas contienen características de las células más diversas que sólo los diámetros de las células (p. ej., material estructural y propiedades de las membranas celulares), y los espectrogramas podrían representar estas características. Este resultado indica que el análisis del espectrograma es necesario para utilizar patrones retrodispersados ​​para tareas de diagnóstico automatizadas más abstractas.

Examinamos si el sistema propuesto puede distinguir células de microesferas de poliestireno de tamaño similar para ir un paso más allá. Como un experimento anterior demostró que las señales retrodispersadas reflejan la diferencia de tamaño, este experimento investigó el efecto de las diferencias de materiales estructurales excluyendo la posibilidad de la diferencia de tamaño. Intentamos distinguir las células PNT1A (\(10.10 \pm 0.88\;\upmu\)m) de microesferas de 10 \(\upmu\)m (\(9.97 \pm 0.07\;\upmu\)m) y RBC (\ (6.57 \pm 0.66\;\upmu\)m) de 5 \(\upmu\)m microesferas (\(4.98 \pm 0.06\;\upmu\)m) usando el sistema propuesto. La Tabla 3 presenta la precisión de las dos tareas de clasificación.

Los clasificadores propuestos distinguieron con precisión los RBC de las microesferas de 5 \(\upmu\)m, mientras que exhibieron una alta variación para las microesferas PNT1A y 10 \(\upmu\)m, como se resume en la Tabla 3. Este resultado podría atribuirse parcialmente al hecho de que el tamaño Las diferencias entre los glóbulos rojos y las microesferas de 5 \(\upmu\)m fueron más significativas que las entre las células PNT1A y las microesferas de 10 \(\upmu\)m. Además, nuestro conjunto de datos, que era de escala relativamente pequeña, podría ser insuficiente para que los clasificadores comprendan las diferencias de material estructural entre las células PNT1A y las microesferas de 10 \(\upmu\)m reflejadas por sus señales retrodispersadas. En futuras investigaciones, intentaremos ampliar el alcance y la escala de este conjunto de datos. Sin embargo, a pesar de la alta variación, los clasificadores propuestos exhibieron una precisión perfecta en la detección de PNT1A al doble entre los tres. Por lo tanto, podemos suponer que los clasificadores pueden capturar las diferencias de materiales estructurales de objetos del tamaño de una micra y las diferencias de tamaño. Además, en este experimento, el análisis del espectrograma superó significativamente a los otros casos, mientras que tanto el análisis del espectro como el del espectrograma mostraron un rendimiento impecable en el primer experimento (Tabla 1). Los cambios temporales en los espectros de frecuencia podrían representar información más abundante para el material estructural de las células (y las microesferas) que los espectros de frecuencia estáticos o las señales de forma de onda.

Esta sección valida la eficacia del espectro de frecuencia y sus cambios temporales para el análisis de características celulares (RQ 2 y RQ 3). Como se indica en la Tabla 1, tanto el análisis del espectro de frecuencia como del espectrograma podrían distinguir los dos tipos de células entre sí con una precisión promedio alta y una varianza baja. Básicamente, las características del dominio de la frecuencia revelaron las características de la célula provocadas por señales retrodispersadas de manera más efectiva que las características del dominio del tiempo. Además, la Tabla 3 indica que las características del dominio tiempo-frecuencia fueron más útiles que las otras dos representaciones de datos. Estos resultados fueron los mismos que los de los métodos ML convencionales (parte inferior de la Tabla 1). Sin embargo, disminuimos la resolución de frecuencia del análisis del espectrograma de 5000 a 513 mediante submuestreo en los experimentos anteriores para abordar la complejidad del tiempo y el espacio. Simultáneamente, mantuvimos la resolución de frecuencia del análisis de espectro en 5000. Por lo tanto, los resultados experimentales anteriores son inadecuados para respaldar la RQ 3. Para abordar este problema, examinamos la precisión de los análisis de espectro y espectrograma basados ​​en una resolución de frecuencia de 125-2000. con un tamaño de paso de \(+ 125\). La Figura 5 muestra los resultados del experimento.

Como se muestra en la Fig. 5, el análisis del espectrograma mostró una precisión alta y constante independientemente de la resolución de frecuencia y superó al análisis del espectro de frecuencia. Por el contrario, el rendimiento del análisis del espectro de frecuencias mostró una tendencia inestable. La medida \(F_1\) para el análisis del espectro de frecuencia era inferior a 0,70 hasta que la resolución de frecuencia llegó a 1750. En particular, su precisión era mucho más severa que su recuperación. Cuando la resolución de los espectros de frecuencia era inferior a 2000, las características celulares reflejadas por las señales retrodispersadas desaparecían. En este caso, los resultados experimentales anteriores en las Tablas 1, 2 y 3 indican que el análisis temporal de los espectros de frecuencia descubrió distintos aspectos de las propiedades de las células, que son diferentes del análisis estático. Además, la reducción de la resolución de frecuencia hace que el análisis temporal sea computacionalmente más eficiente que el análisis estático.

Realizamos una prueba de ablación para los métodos de reducción de ruido utilizados en el sistema propuesto. El notable rendimiento del sistema propuesto puede provocar el malentendido de que los modelos CNN propuestos están sobreexigidos y que las características convencionales podrían ser capaces de clasificar células. Sin embargo, las señales retrodispersadas de las células son extremadamente ruidosas y extraer características esenciales bajo ruido con heurísticas convencionales es más difícil. Intentamos demostrar esto mediante una prueba de ablación para el codificador automático de eliminación de ruido y la inyección de ruido gaussiano. Comparamos el rendimiento del sistema propuesto que emplea los métodos de eliminación de ruido propuestos (DN+) para clasificar glóbulos rojos y células PNT1A con un caso que utiliza solo el codificador automático de eliminación de ruido (DN) y otro caso sin ninguna técnica de eliminación de ruido (Raw). La Tabla 4 presenta los resultados experimentales de las contribuciones de los métodos de eliminación de ruido propuestos a la precisión de nuestro sistema automatizado de clasificación de tipos de células.

Como se enumera en la Tabla 4, los tres casos exhibieron precisiones similares en los análisis de forma de onda y espectrograma. Sin embargo, DN+ superó claramente a los otros dos casos en el análisis del espectro de frecuencia. Este resultado indica que nuestros métodos de reducción de ruido recuperan eficazmente las características del dominio de frecuencia de las señales retrodispersadas de las células. Sin embargo, el codificador automático de eliminación de ruido propuesto no podría contribuir a la precisión de la clasificación sin la inyección de ruido gaussiano. El aumento de datos mediante inyección de ruido gaussiano permitió entrenar el codificador automático y los clasificadores propuestos para distinguir las características importantes de la señal del ruido. Además, los tres clasificadores fueron entrenados utilizando el mismo método de aumento de datos (no solo en el paso de eliminación de ruido), pero el ruido solo afectó el análisis del espectro de frecuencia. Por lo tanto, podemos conjeturar que las características temporales de las señales retrodispersadas son más robustas al ruido que las características del dominio de la frecuencia.

Este estudio tuvo como objetivo clasificar automáticamente las células vivas según los tipos de células mediante el análisis de los patrones de las señales retrodispersadas de las células. Un estudio anterior28 aplicó la técnica de detección acústica sin etiquetas para determinar las diferencias de tamaño entre los glóbulos rojos y las células cancerosas PNT1A midiendo los coeficientes IB de las señales retrodispersadas con posprocesamiento manual. Sin embargo, el análisis automático de los patrones de las señales retrodispersadas nos permitió evitar procesos que consumen mucho tiempo y posibles errores causados ​​por el análisis manual. Este estudio demostró un novedoso sistema automatizado de clasificación de tipos de células combinando la detección acústica sin etiquetas de un único objeto atrapado28 con un codificador automático convolucional 1D y clasificadores CNN. Los experimentos y preguntas de investigación fueron diseñados para validar la efectividad de cada módulo del sistema propuesto. Primero, verificamos la efectividad de los patrones de señales retrodispersadas para clasificar tipos de células aplicando el sistema propuesto a dos tipos de células (RBC y PNT1A) y dos tipos de microesferas de poliestireno (5 y 10 \(\upmu\)m). Utilizando células y microesferas, realizamos tres experimentos para identificar: (1) glóbulos rojos y células cancerosas, (2) microesferas de poliestireno de diferentes tamaños y (3) células y microesferas de poliestireno de tamaño similar. También comparamos los tres métodos de preprocesamiento para examinar si los tipos de características en las señales retrodispersadas (por ejemplo, dominios de tiempo y frecuencia) estaban correlacionados con las propiedades físicas de objetos del tamaño de una micra. Los resultados experimentales indicaron que los patrones de señal retrodispersados ​​reflejan diámetros celulares y otras propiedades físicas, como diferencias de materiales estructurales, lo que revela la importancia de comprender su relación con cambios moleculares, arquitectónicos y de comportamiento fundamentales asociados con el estado celular y los procesos patológicos63,64. En consecuencia, las características del dominio del tiempo y de la frecuencia fueron importantes para analizar las características de las células. En términos de modelos de ML, la necesidad de los clasificadores de CNN se demostró comparando su rendimiento con los modelos de ML convencionales, y la eficacia del codificador automático de eliminación de ruido se validó mediante pruebas de ablación.

En las Tablas 1 y 2, la diferencia de tamaño podría ser uno de los factores importantes que afectan los patrones de las señales retrodispersadas de partículas o células. En consecuencia, llegamos a una conclusión que es consistente con un estudio anterior28. Sin embargo, como se resume en la Tabla 3, el sistema propuesto mostró una alta precisión al distinguir células de microesferas de poliestireno de tamaño similar. Este resultado indica que las propiedades físicas del material estructural también afectan los patrones de señal retrodispersada, no solo los tamaños. El sistema propuesto distinguió con precisión los glóbulos rojos de las microesferas de 5 \(\upmu\)m, a pesar de la gran variación en la clasificación de PNT1A y las microesferas de 10 \(\upmu\)m. Este resultado podría deberse a diferencias de tamaño y al material estructural. Aunque la diferencia de tamaño entre los glóbulos rojos y las microesferas de 5 \(\upmu\)m fue ligeramente mayor que la diferencia entre las células PNT1A y las microesferas de 10 \(\upmu\)m, la diferencia de la microestructura junto con la mecánica celular puede contribuir como un factor secundario. . Estudios anteriores han demostrado que el núcleo celular es el más rígido con un objeto densamente empaquetado en comparación con el citoplasma circundante65,66 y el diámetro promedio del núcleo es aproximadamente de 5 a 20 \(\upmu\)m en células de mamíferos67, lo cual es similar a o incluso mayor que el diámetro promedio de los glóbulos rojos. Por el contrario, cuando maduran, los glóbulos rojos de los mamíferos no tienen núcleo celular68 y se deforman fácilmente para viajar eficientemente a través de los capilares69. Además, en óptica, los núcleos celulares tienen un índice de refracción y una densidad de masa diferentes en comparación con el citoplasma70,71. Por lo tanto, tales diferencias de microestructura junto con la mecánica celular pueden estar involucradas en la alta variación para clasificar las células PNT1A y las microesferas de 10 \(\upmu\)m en comparación con los glóbulos rojos y las microesferas de 5 \(\upmu\)m, pero esto será intensivo explorado con conjuntos de datos a gran escala en el futuro.

El sistema propuesto mostró una precisión excelente para la clasificación celular, mientras que los métodos convencionales mostraron una precisión baja, como se enumera en la Tabla 1. Estos resultados indican que el uso de modelos potenciados por el aprendizaje profundo puede exagerarse, y un sistema bien diseñado con métodos convencionales puede lograr un rendimiento comparable. Sin embargo, experimentos posteriores (Fig. 5 y Tabla 4) indicaron que el sistema propuesto (particularmente el caso de análisis de espectrograma) puede superar la resolución de baja frecuencia y la ausencia de eliminación de ruido. Debido a que las señales retrodispersadas de las células eran pequeñas y tenían ruido no deseado, es difícil esperar que los algoritmos de aprendizaje automático convencionales y los métodos manuales basados ​​en heurísticas puedan descubrir características esenciales relacionadas con las características de las células entre ruidos y reflejos insignificantes. Además, estos resultados indican que la combinación de características en los dominios del tiempo y la frecuencia mejora la precisión del descubrimiento de las propiedades de las células, la robustez al ruido y la reducción de la resolución. Básicamente, los cambios temporales en los espectros de frecuencia podrían contener información más abundante y distintiva sobre las propiedades físicas de las células, incluido el tamaño y el material estructural, que los espectros de frecuencia estáticos o las señales de forma de onda.

El sistema propuesto puede clasificar células vivas con precisión sin utilizar posprocesamiento manual, en comparación con el estudio anterior28. Sin embargo, el sistema propuesto tiene algunas limitaciones que deberían abordarse en futuras investigaciones. Primero, nuestros experimentos se realizaron utilizando dos tipos de células (RBC y PNT1A) y dos tipos de microesferas (5 y 10 \(\upmu\)m). Aunque demostramos que nuestro sistema podría considerar varias características celulares (no solo diámetros) al clasificar células y microesferas con tamaños similares, más investigaciones deberían examinar más tipos de células con varios tamaños para validar esta noción. También debería aumentarse el número de células y de señales retrodispersadas. En este estudio, recopilamos 154 señales de 24 células y 146 señales de 31 microesferas de poliestireno. Aunque los resultados de la validación cruzada mostraron que la alta precisión del sistema propuesto no fue el resultado de un sobreajuste, la cantidad de células y muestras no fue suficiente para mostrar la diversidad de células vivas. Al ampliar el conjunto de datos, nuestra investigación futura se centrará en descubrir correlaciones entre las características físicas y funcionales de las células y los patrones de señales retrodispersadas de las células. Las correlaciones descubiertas pueden dilucidarse y posteriormente traducirse a la medicina clínica que implican la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud bajo la Subvención no. P41-EB002182 (KKS), en parte por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) Subvención financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2022R1F1A1065516) (O.-JL), en parte por la Fundación Nacional de Investigación de Corea ( NRF) Subvención financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2022R1A5A8023404) (HGL), y en parte por el proyecto de I+D “Desarrollo de un sistema de asimilación de datos de próxima generación por el Instituto Coreano de Sistemas de Predicción Atmosférica (KIAPS)”. financiado por la Administración Meteorológica de Corea (KMA2020-02211) (H.-JJ).

Estos autores contribuyeron igualmente: Hyeon-Ju Jeon y Hae Gyun Lim.

Grupo de Asimilación de Datos, Instituto Coreano de Sistemas de Predicción Atmosférica, Seúl, 07071, República de Corea

Hyeon-Ju Jeon

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Nacional Pukyong, Busan, 48513, República de Corea

Hae Gyun Lim

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA, 90089, EE. UU.

K. Kirk Shung y Min Gon Kim

Departamento de Inteligencia Artificial, Universidad Católica de Corea, Bucheon, 14662, República de Corea

O-Joun Lee

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MGK, O.-JL y HGL concibieron la idea. MGK y KKS diseñaron y realizaron los experimentos de ultrasonido. H.-JJ y O.-JL analizaron los datos. O.-JL, HGL y MGK interpretaron los datos. H.-JJ y MGK redactaron el manuscrito. Todos los autores revisaron los resultados y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a O-Joun Lee o Min Gon Kim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Recibido: 17 de mayo de 2022

Aceptado: 10 de octubre de 2022

Publicado: 18 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22075-6

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